Ziehl-Nielsenova metoda barvení (podle Ziehl-Nelsen [1] ) je barvicí metoda pro mikroorganismy k detekci acidorezistentních mykobakterií (původců tuberkulózy , mykobakteriózy , lepry ), aktinomycet a dalších acidorezistentních mikroorganismů . Odolnost mikroorganismů vůči kyselinám je způsobena přítomností lipidů , vosků a hydroxykyselin v jejich buňkách . Takové mikroorganismy se zředěnými roztoky barviv špatně barví. Pro usnadnění pronikání barviva do buněk mikroorganismů se karbolický fuchsin Tsilya aplikovaný na přípravek zahřívá nad plamenem hořáku. Barevné mikroorganismy neodbarvují slabé roztoky minerálních kyselin a alkoholu.
Metoda je pojmenována po německých lékařích - mikrobiologovi Franzi Zielovi a patologovi Friedrichu Nelsenovi ( Nielsen), kteří ji vyvinuli v letech 1882-1883 .
0,3 g methylenchloridu se rozpustí ve 100 ml destilované vody.
Bakterie odolné vůči kyselinám při obarvení touto metodou intenzivně zčervenají , zbytek mikroflóry se zbarví světle modře [3] .
Acidrezistentní Mycobacterium tuberculosis jsou přibližně 1-10 mikronů dlouhé a 0,2-0,6 mikronů široké. Obvykle jsou vidět ve formě tenkých elegantních tyčinek, ale někdy můžete najít zakřivené nebo zkroucené možnosti. Při barvení karbolickým fuchsinem je mycobacterium tuberculosis detekováno jako tenké, mírně zakřivené malinově červené tyčinky obsahující různý počet granulí. Mikroorganismy, umístěné jednotlivě, v párech nebo ve skupinách, dobře vynikají na modrém pozadí ostatních složek drogy. Není neobvyklé, že bakteriální buňky tvoří římskou číslici „V“.
Uvnitř jednotlivých mikrobiálních buněk mohou být nalezeny oblasti intenzivnějšího zbarvení, což má za následek „perličkovitý“ vzhled, zatímco slaběji zbarvené oblasti lze považovat za „proužky“. V preparátu lze detekovat i pozměněné koky kyselinovzdorné formy patogenu, zaoblené kulovité nebo myceliové struktury. V případě detekce změněných forem acidorezistentních mikroorganismů však musí být pozitivní odpověď potvrzena dalšími výzkumnými metodami.
Některé další mikroorganismy, které nejsou příbuzné s M.tuberculosis , mohou mít různé formy – od dlouhých tyčinek až po kokoidní formy s různou intenzitou zbarvení. Různý stupeň acidorezistentního zbarvení lze pozorovat nejen u mykobakterií, ale i u jiných mikroorganismů. Mohou to být Rhodococcus , Nocardia, Legionella , stejně jako cysty Cryptosporidium a Isospora . Rychle rostoucí mykobakterie se mohou lišit stupněm kyselinostálé barvy – při částečné ztrátě kyselinostálé barvy získávají purpurově karmínovou barvu.
V kulturní studii je odpověď o izolaci acidorezistentních mykobakterií dána až po mikroskopii Ziehl-Neelsenově obarveného nátěru z rostoucích kolonií. Při přípravě nátěrů pro mikroskopické vyšetření vykazují kolonie Mycobacterium tuberculosis své fyzikální a chemické vlastnosti: v izotonickém roztoku neemulgují, ale tvoří zrnitou, drobivou suspenzi. To je způsobeno přítomností velkého množství hydrofobních tukových vosků ve složení jejich buněčné stěny. Mikroskopické zkoumání nátěrů z vyrostlých kolonií, obarvených podle Ziehla-Nelsena, odhaluje jasně karmínově červené tyčinkovité bakterie ležící jednotlivě nebo ve skupinách, tvořící shluky nebo vazby ve formě „plsti“ nebo „copů“. Tuberkulózní mykobakteria vypadají jako tenké, rovné nebo mírně zakřivené tyčinky 1–10 (obvykle 1–4) µm dlouhé, 0,2–0,6 µm široké, homogenní nebo zrnité s mírně zaoblenými konci. Častěji jsou v preparátu, zejména u dlouho rostoucích kultur, viditelné nahromadění tmavě zbarvených zrn. V mladých kulturách, zejména izolovaných od pacientů dlouhodobě léčených antituberkulotiky, se mykobakteria vyznačují vysokým polymorfismem až výskytem krátkých, téměř kokoidních forem.
Mikroskopické vyšetření nátěru by mělo prozkoumat alespoň 100 zorných polí, aby bylo možné kvantifikovat léčivo a detekovat jednotlivé mykobakterie. V případě, že je výsledek takové studie negativní, je pro potvrzení zobrazeno dalších 200 zorných polí. Při značném počtu acidorezistentních mykobakterií stačí vyšetřit 20-50 zorných polí jak Ziehl-Neelsenovým barvením, tak fluorescenční mikroskopií (viz tabulka ). Při mikroskopickém zkoumání preparátu je nutné mít jistotu, že žádné zorné pole preparátu není prohlíženo opakovaně, proto se doporučuje prohlížet preparát vždy podle stejného schématu:
Začnou si prohlížet preparát z levého horního zorného pole vybraného v nátěru, postupně se pohybují buď podél podélné osy přípravku ke konci nátěru, nebo se pohybují dolů a pak zase stoupají nahoru atd., procházejí všemi zorná pole k hranici stěru. Při zvětšení mikroskopu 1000x, tedy 100x pro olejový imerzní objektiv a 10x pro okulár, se při zkoumání délky jednoho zdvihu (~ 20 mm) zobrazí v jednom podélném průchodu asi 100-120 zorných polí (průměr pole - 0,16 - 0,2 mm).
| Výsledek výzkumu | Minimální počet zorných polí (p / s) | Formulář pro záznam výsledku | Interpretace studijních výsledků |
|---|---|---|---|
| AFB [4] nebyl detekován při 300 p/s | 300 | OTR. | Negativní |
| 1 - 2 KUM za 300 p/s | 300 | Doporučuje se studii opakovat | Výsledek se nehodnotí |
| 1 - 9 KUM ve 100 p/s | 100 | "_N__" KUM ve 100 p/s [5] | Pozitivní |
| 10 - 99 KUM ve 100 p/s | 100 | 1+ [6] | Pozitivní |
| 1 - 10 KUM za 1 p/s | padesáti | 2+ [6] | Pozitivní |
| Více než 10 KUM za 1 p/s | dvacet | 3+ [6] | Pozitivní |