Ochoa, sever

Severo Ochoa
španělština  Severo Ochoa de Albornoz
Datum narození 24. září 1905( 1905-09-24 ) [1] [2] [3] […]
Místo narození Luarca , Španělsko
Datum úmrtí 1. listopadu 1993( 1993-11-01 ) [1] [2] [3] […] (ve věku 88 let)
Místo smrti Madrid , Španělsko
Země  Španělsko USA 
Vědecká sféra biochemie
Místo výkonu práce
Alma mater
Akademický titul PhD ( 1930 )
vědecký poradce Otto Meyerhof
Henry Dale
Studenti Manuel Losada Villasante [d]
Ocenění a ceny Nobelova cena Nobelova cena za fyziologii a medicínu ( 1959 )
Premio Lección Conmemorativa Jiménez Díaz ( 1969 )
Americká národní medaile za vědu ( 1979 )
 Mediální soubory na Wikimedia Commons

Severo Ochoa de Albornoz ( španělsky  Severo Ochoa de Albornoz ; 24. září 1905 , Luarca , Španělsko  – 1. listopadu 1993 , Madrid ) – španělský a americký biochemik, nositel Nobelovy ceny za fyziologii a medicínu v roce 1959 „za objev mechanismy biosyntézy RNA a DNA“ [5] (spolu s A. Kornbergem ).

Biografie a vědecké práce

Vzdělání. První práce

Severo Ochoa se narodil 25. září 1905 v Luarce, malém městě v Asturii, na pobřeží Atlantského oceánu [6] . Byl nejmladším ze sedmi synů, jeho otec byl právník a obchodník a zemřel, když bylo Severovi 7 let.

Po smrti svého otce se rodina, která se snažila žít ve středomořském klimatu, přestěhovala do Malagy na pobřeží, kde žila od poloviny září do poloviny června. Severo tam chodil na soukromou školu podporovanou jezuity a poté na střední školu, kde v roce 1921 získal bakalářský titul. Během posledního roku na střední škole se začal zajímat o přírodní vědy a v roce 1923 vstoupil na lékařskou fakultu univerzity v Madridu. Nikdy netoužil být lékařem, ale medicína mu umožnila studovat biologii. Byl fascinován španělským neurovědcem Santiago Ramón y Cajal a snil o tom, že pod ním bude studovat histologii. Ale k Severově velké lítosti, když nastoupil na lékařskou fakultu, Cajal, kterému už bylo přes 70 let, se od vědy vzdálil. Severo Ochoa se však nikdy neomrzel znovu číst Cajalovu biografii a jeho kniha Poradenství pro vědecký výzkum měla na Ochoa obrovský dopad. Ve třetím ročníku lékařské fakulty se Ochoa rozhodne zasvětit svůj život studiu biologie.

Druhým učencem, který měl na Severa Ochou silný vliv, byl jeden z jeho učitelů Juan Negrin , který byl v Německu. Ochoovi poradil, aby četl jiné knihy než španělské. V té době byl jediným cizím jazykem, kterým Ochoa mluvil, francouzština a jeho následné rozhodnutí jít na doktorát do Německa a Anglie bylo podníceno touhou učit se cizí jazyky. Profesor Negrin dal Severovi Ochoovi a jeho příteli José Valdecasasovi příležitost, aby ve svém volném čase provedli nějaký výzkum v jeho laboratoři. Navrhl, aby izolovali kreatinin z moči. Severo Ochoa se začal zajímat o funkce a metabolismus kreatinu a kreatininu. Ochoa a Valdecasas navrhli jednoduchou mikrometodu pro stanovení koncentrace kreatinu ve svalech [7] . Pro aplikaci této metody a zvládnutí anglického jazyka strávil Ochoa 2 měsíce v Glasgow s profesorem Noelem Patonem, který pracoval na metabolismu kreatinu. Když se vrátil do Španělska s dobrou znalostí angličtiny (měl přirozenou schopnost učit se jazyky), zaslal článek do Journal of Biological Chemistry popisující jeho metodu pro kvantifikaci kreatinu a s potěšením zjistil, že tato metoda byla po malém testování přijata. [8] . Studium kreatinu podnítilo Ochoův zájem o chemii svalové kontrakce a o práci německého vědce Otto Meyerhoffa o fosfokreatinu, nově objevené sloučenině.

Práce v Německu a Anglii

Otto Meyerhof pracoval v Kaiser Wilhelm Institute (KWI), založeném v roce 1910 v Dahlemu, módním předměstí Berlína. Průmyslníkům a bankéřům, kteří si uvědomovali, že blahobyt Německa je založen na rychlém rozvoji základních věd, byly poskytnuty velké finanční prostředky. Dvě významné osobnosti v biochemii – Karl Neuberg, ředitel Institutu, a Otto Warburg – pracující v KWI Meyerhof se zajímali o problém: jak se potenciální energie potravy stane dostupnou buňce? Sval si vybral jako experimentální model, aby se pokusil najít souvislost mezi chemickými přeměnami a produkcí tepla a mechanickou prací. Severo Ochoa požádal Meyerhofa, aby mu dovolil věnovat nějaký čas ve své laboratoři studiu svalové kontrakce a Německa obecně. K jeho radosti tam byl přijat a do laboratoře dorazil na podzim roku 1929. Severo Ochoa neuměl německy, ale Meyerhof mluvil anglicky a o dva měsíce později se Severo Ochoa naučil německy v míře, která stačila pro další komunikaci. Fritz Lipman a David Nachmanson také pracovali na KWI mezi dalšími doktorandy. Jedním z pozoruhodných rysů KWI byla touha odstranit bariéru mezi fyzikou, chemií a biologií. KWI dala obrovskou podporu mladým biochemikům jako Severo Ochoa a Fritz Lipman. Severo Ochoa studoval, jak může svalová kontrakce využít jinou energii než tu z rozkladu sacharidů a zda rozklad fosfokreatininu ovlivnil kontrakce. Odpověď přišla později (po objevu ATP), když Loman zjistil, že fosfokreatin regeneruje ATP přenosem PO4 na ADP. Na konci roku 1929 se Meyerhof přestěhoval z Dahlemu do Heidelbergu, kde Společnost císaře Viléma postavila krásnou novou budovu, včetně čtyř výzkumných ústavů (fyzikální, chemický, fyziologický a experimentální medicína). Meyerhof byl jmenován ředitelem Fyziologického ústavu a Severo Ochoa se s ním přestěhoval do Heidelbergu. V roce 1930 se vrátil do Madridu s tezí o úloze nadledvin při svalové kontrakci a v roce 1931 se oženil s Carmen Cobian Garcia. Brzy opět odešel do zahraničí (s manželkou) do laboratoře Henryho Dalea (National Institute for Medical Research v Londýně), kde pracoval na svém prvním enzymu, glyoxyláze, udržoval přátelské vztahy s univerzitou v Madridu. Ochoa zůstal v Londýně dva roky a vrátil se ze svého výzkumu glyoxylázy k roli nadledvin při svalové kontrakci.

Konec 30. let 20. století. Stěhování do USA

V roce 1935 byl Ochoa povýšen na ředitele oddělení fyziologie v novém institutu v Madridu. Ale o několik měsíců později začala španělská občanská válka a on se rozhodl opustit Španělsko a vrátit se do Meyerhofu. Když Ochoa v roce 1936 dorazil do Německa, země byla na vrcholu nacismu a Meyerhofova pozice byla nejistá. Jeho laboratoř však pracovala produktivně, ale došlo v ní k vážným změnám: z laboratoře fyziologie se stala laboratoř biochemie. Hlavními předměty studia byly glykolýza a fermentace ve svalech, izolace kvasinek a dílčí reakce katalyzované purifikovanými enzymy. Toto období však netrvalo dlouho, dokud se Meyerhof v srpnu 1939 přestěhoval do Paříže, kde se připojil k Ústavu biologie a fyzikální chemie. Před odjezdem získal Meyerhof Ochoa na šest měsíců práci v laboratoři mořské biologie v Plymouthu. Nakonec Ochoa spolupracoval s Rudolfem Petersem na Oxfordské univerzitě. Práce s Petersem o úloze vitaminu B1 (thiamin) a kokarboxylázy (thiamin pyrofosforester) při oxidaci pyruvátu byla velmi produktivní [9] [10] . Zjistili, že koenzymy v tomto procesu v mozku holubů jsou kokarboxyláza a konjugovaný thiamin. Ukázali také potřebu adeninových nukleotidů, což naznačuje blízkou koexistenci oxidace a fosforylace, což zvýšilo zájem Ochoa o oxidativní fosforylaci. Oxfordské období však netrvalo dlouho kvůli druhé světové válce. Laboratoř byla využívána pro válečné práce a Ochoa jako cizinec byl propuštěn. Rozhodne se odcestovat do Spojených států a napíše Carlovi a Gertie Corey ( Washington University School of Medicine v St. Louis ); vezmou ho tam. Corey najde finance a v srpnu 1940 odplouvají Carmen a Severo Ochoa do Spojených států. Laboratoř Carla a Gertie Coreyových byla úžasným místem: důraz byl kladen na enzymy, zejména glykogen fosforylázu. Ochoa se hodně naučil, i když jeho vlastní práce o enzymatickém mechanismu přeměny fruktózy na glukózu v jaterním extraktu byla spíše zklamáním. Pochopil však důležitost technik izolace a charakterizace enzymů a osvojil si je. V roce 1942 nastoupil na pozici výzkumného asistenta na New York University School of Medicine (NYU).

Intermediální metabolismus

Ochoa pracoval dva roky na New York University School of Medicine, poté se přestěhoval na Biochemické oddělení ve staré budově přes ulici, kde nastoupil na pozici asistenta biochemie. O dva roky později se stal farmakologem. Farmakologická fakulta také sídlila ve staré budově a měla nové laboratoře, takže Severo Ochoa získal více prostoru a rozšířil svou činnost, nabíral studenty a pracovníky s diplomem. Jeho první výzkum na New York University byl na oxidativní fosforylaci. Předtím v Oxfordu Severo Ochoa ukázal, že oxidace doprovází fosforylaci AMP na ATP po přenosu fosforu z ATP na cukr [11] . Významným objevem je povinná koexistence fosforylace a oxidace pyruvátu, kterou prokázali také Belitzer v SSSR a Kalkar v Dánsku. Pomocí srdečního homogenátu určil atomový poměr esterifikovaného fosforu ke spotřebovanému kyslíku (P/O poměr). Srovnání fosforylace způsobené oxidací kyseliny pyrohroznové s fosforylací způsobenou dismutací kyseliny pyrohroznové a kyseliny fosfoglycerové v extraktu srdce poskytlo P/O = 3 pro první reakci [12] . Dříve to bylo 2; nízká hodnota P/O byla způsobena ztrátami způsobenými hydrolýzou ATP ATPázou. Hodnotu 3 dále potvrdil A. Lehninger pomocí mitochondrií. Po dokončení této práce se Severo Ochoa domníval, že mechanismus oxidativní fosforylace nelze pochopit bez dalších znalostí o enzymatických reakcích, ke kterým dochází během oxidace, zejména těch, které doprovázejí fosforylaci. Jak bylo známo díky Krebsovi, cyklus trikarboxylových kyselin je hlavní oxidací potravy v buňce a Keelin a Warburg ve své práci ukázali, že se na tomto procesu podílejí pyridinové nukleotidy, flavoproteiny a cytochromy. Ochoa si ke studiu vybral isolimondehydrogenázu.

Bylo známo, že isocitrát vzniká z citrátu pomocí cis-akonitátu, ale reakce vedoucí k α-ketoglutarátu nebyla prokázána, pouze předpovězena a Ochoa se rozhodl připravit domnělý meziprodukt „kyselina oxalosukcinová“, čehož dosáhl po několika neúspěšné pokusy. Počínaje kyselinou oxalosukcinovou pozoroval tvorbu a-ketoglutarátu a dospěl k závěru, že kyselina oxalosukcinová byla skutečně meziproduktem této reakce. Mezitím biochemiky ohromil fenomén fixace CO 2 probíhající v heterotrofní bakterii, který prokázali Wood a Werkman. Ochoa došel k závěru, že reakce isolimondehydrogenázy je reverzibilní a určuje mechanismus procesu fixace CO 2 v živočišných buňkách. Laboratoř Severo Ochoa nebyla vybavena přístroji využívajícími izotopy; rozhodl se, že by mohl studovat reakci, která by měla vyústit v oxidaci NADPH spektrofotometrií, pokud isocitrát vzniká fixací CO 2 na α-ketoglutarát. Jak však píše ve Výročních recenzích, nevěřil, že to bude fungovat, a experiment odložil, dokud ho nepovzbudil Evraim Rucker. Poslední jmenovaný pracoval na katedře mikrobiologie o patro níže a probíhalo mezi nimi mnoho diskusí. Když Ochoa konečně provedl experiment a viděl, jak se ručička spektrofotometru pohybuje, což naznačuje oxidaci NADPH [13] , byl tak rozrušený štěstím, že vyběhl ven a zakřičel: „Běž se podívat, jak se ručička spektrofotometru pohybuje!“. Ale vzhledem k tomu, že už bylo 21 hodin, nikdo kolem nebyl. Spektrofotometr, na kterém byl experiment proveden, byl darován Americké filozofické společnosti a měl být vrácen o rok později, ale úspěch experimentů a potřeba spektrometru pro další práci přinutila společnost Ochoa ponechat si přístroj. Poté se stává virtuosem ve spektrofotometrickém studiu oxidačních enzymů; často mohla být studovaná reakce spojena se třemi nebo čtyřmi dalšími enzymatickými reakcemi, dokud nebyl řetězec dokončen, a reakce závislé na NAD nebo NADP, ve kterých byly pyridinové nukleotidy oxidovány nebo redukovány, by mohly poskytnout základ pro kontinuální spektrometrické studium enzymové aktivity. Tento spektrofotometr byl dlouhou dobu jediný na celé fakultě – úspěšné americké laboratoře na tom nebyly tak dobře, jak se někdy zdálo.

Během této doby měl Severo Ochoa svého prvního postgraduálního studenta Alana Mehlera a také dva postgraduální studenty: Santiago Grisolia a Arthur Kornberg. Jednoho dne si Alan při pozorování tvorby pyruvátu z malátu všiml rychlé oxidace malátu, když byl do extraktu z holubích jater přidán NADP. To vedlo k objevu „jablkového“ enzymu – malátdehydrogenázy [14] . Enzym katalyzuje vratnou reakci:

malát + NADP ↔ pyruvát + CO 2 + NADPH + H.

Enzym "jablko" také katalyzuje tvorbu pyruvátu z oxaloacetátu, přičemž dochází k uvolňování CO 2 a redukci NADPH malátu. Působí při oxidaci mastných kyselin zprostředkované koenzymem A a NADPH. Došli k závěru, že se jedná o jeden enzym se dvěma aktivními místy. To jim připomnělo reakci isocitrát dehydrogenázy a vedlo je k závěru, že isocitric dehydrogenáza, která katalyzuje dvě reakce, jak již bylo zmíněno dříve, má také dvě aktivní místa: jedno pro isocitrát , druhé pro oxidaci kyseliny oxalosukcinové, a že je není směs dvou enzymů - isolimondehydrogenázy a oxalosukcindehydrogenázy - jak se dříve myslelo.

Enzym „jablko“ použili Wolf Vishniak a Ochoa pro redukční karboxylaci pyruvátu na malát v přítomnosti granu špenátu a NADPH [15] . Jednalo se o první ukázku fotochemické redukce pyridinových nukleotidů pomocí chloroplastových přípravků. V roce 1948 se Joe Stern, bývalý postgraduální student Hanse Krebse, přestěhoval do laboratoře Severo Ochoa s hodností doktora věd. Ochoa se rozhodne, že je čas zapracovat na nejzajímavějším enzymu v Krebsově cyklu, na tom, který vyrábí citrát z oxaloacetátu a aktivního acetátu. Byl znám jako „kondenzovatelný“ enzym. Extrakt živočišné tkáně byl však při syntéze citrátu neaktivní, ale neztratili odvahu a věřili, že je to kvůli nerozpustnosti enzymu. Vyměnili bakterii v naději, že se enzym rozpustí. Použití organismů nejvhodnějších k vyřešení problému bylo charakteristickým znakem Severa Ochoa. Konečně, spojením extraktů z Escherichia coli a prasečího srdce, dosáhnou dobré syntézy citrátu z acetylfosfátu a oxaloacetátu v přítomnosti katalytického množství koenzymu A. Jak později zjistil Earl Stadtman, extrakt z E. coli „chrání "enzym transacetyláza." Tento enzym katalyzuje přenos acetylové skupiny z acetylfosfátu na koenzym A za vzniku acetyl CoA + PO4. Extrakt z vepřového srdce chrání kondenzační enzym. Vyčistili kondenzační enzym do homogenního stavu a Ochoa přidáním několika kapek síranu amonného jej vykrystalizovala [16] . Byl velmi pyšný a krystaly fotil. Později ve společné studii s Feodorem Linenem prokázal, že kondenzační enzym katalyzuje reverzibilní přeměnu acetyl CoA a oxaloacetátu na CoA + citrát [17] . Ochoa se skutečně velmi zajímal o raná stádia oxidace pyruvátu. Irvin Gonzalus zároveň nějaký čas pracuje na grantu a spolu se Seymourem Corquesem a Alicí del Campillo studuje oxidaci pyruvátu v Escherichia coli [18] . Laboratoř Ochoa si uvědomila důležitost acetyl CoA jako meziproduktu v metabolismu a začala zkoumat důležitou otázku metabolismu mastných kyselin. CoA transferázu objevili Joe Stern a Minor Kuhn [19] . Joe Stern také identifikoval enzym krotonázu, který krystalizoval Alice del Compiglio. Krotonáza katalyzuje dehydrataci β-hydroxybutyryl CoA za vzniku krotonyl CoA. Crotonil CoA se dále převádí na butyryl CoA. Tento enzym je blízce příbuzný sloučenině vzniklé oxidací lichých mastných kyselin a některých aminokyselin.

Existuje také několik zpráv, že oxidace propionátu zahrnuje fixaci CO2 a vede k tvorbě sukcinátu . Severo Ochoa žádá Martina Flavina, který se ke skupině připojil, aby proces prošetřil. Flavin pomocí extraktu z prasečího srdce zjistil, že tento extrakt přeměňuje propionát na dikarboxylovou kyselinu, ale tato kyselina není jantarová, ale methylmalonát [20] [21] . Práce M. Flavina, J. Casira, E. Leone, P. Langiela, R. Matsundera a dalších ukazují, že propionát je nejprve přeměněn na propionyl CoA karboxylázu, enzym obsahující biotin; pak methylmalonyl CoA isomerizuje na formy A a B. B-forma poskytuje sukcinyl CoA z methylmalonylmutázy [22] ; mutáza je enzym B12. Propionyl CoA karboxyláza krystalizovaná Casiro je karboxylována a přenáší karboxylovou skupinu na propionyl CoA.

Zajímavý enzym cyklu trikarboxylových kyselin objevený Kaufmanem ve špenátu katalyzuje syntézu ATF z ADF, Pi a sukcinyl CoA. Sukcinyl CoA byl poté deacetylován na sukcinát a CoA [23] [24] . Enzym byl označen jako fosforylující enzym nebo P-enzym a poté sukcinthiokenáza. P-enzym se účastní fosforylace podzemí po dekarboxylaci ketoglutarátu v Krebsově cyklu. Tento enzym přesvědčil Ochoa, aby se vrátil ke studiu oxidativní fosforylace.

Polynukleotid fosforyláza

V roce 1955 spolu s postgraduální studentkou Mariannou Grünberg-Manago (rodáčkou z Ruska, později známou biochemičkou působící ve Francii) izoloval nový enzym z mikroorganismu Azotobacter vinelandi, který katalyzoval in vitro syntézu molekuly podobné na RNA, skládající se ze 4, 3, 2 a dokonce jedné dusíkaté báze. Enzym dostal název „polynukleotid fosforyláza“. Pečlivé experimenty ukázaly, že syntetický polyribonukleotid svou velikostí připomíná přírodní RNA. Jeho molekulová hmotnost se pohybovala od 30 000 do 1-2 x 106 Da. Sedimentační konstanty byly také podobné. K provedení spolehlivé reakce syntézy RNA byl zapotřebí vysoce purifikovaný enzym, pro který byla použita chromatografie. Kromě toho bylo pro zahájení syntézy nutné přidat do roztoku malé množství oligomeru, poté roste polymerní řetězec. Když se syntetizovaný polymer podobný RNA zpracuje pankreatickou ribonukleázou, získá se směs oligonukleotidů, stejná, jako když se štěpí přirozená RNA za podobných podmínek. V experimentech s hydrolýzou syntetizovaného polymeru pomocí fosfodiesterázy izolované z hadího jedu a tkáně sleziny se ukázalo, že experimentálně získaná RNA je lineární řetězec, jehož nukleosidové jednotky jsou spojeny 3,5'-fosfodiesterovými můstky. O dva roky později Arthur Kornberg izoloval enzym DNA polymerázu z Escherichia coli a použil jej k syntéze DNA. V roce 1959 byla oběma vědcům udělena Nobelova cena [25] [26] [27] [28] .

Genetický kód

Od objevu polynukleotidové fosforylázy se laboratoř Severo Ochoa soustředila hlavně na dvě věci: oxidaci propionátu, kterou zkoumali lékaři, kteří přišli po odchodu Martina Flavina, a samotnou polynukleotidovou fosforylázu. Ochoa pracoval s novým japonským vědcem Sanai Mi na fúzní reakci a doufal, že s dalším čištěním enzymu, primeru nebo templátu budou objasněna omezení. Ve skutečnosti to byl jediný případ, kdy proteolyzující enzym potřeboval primer pro syntézu polymeru. Ačkoli se tyto studie v budoucnu neukázaly jako užitečné při určování role enzymu in vivo , byly extrémně užitečné při syntéze mnoha polymerů. Ochoova laboratoř tak byla připravena na in vitro experimenty s genetickým kódem.

Obecný koncept mRNA byl formulován v 60. letech a v roce 1961 Nirenberg a Mattai na Mezinárodním biochemickém kongresu v Moskvě uvedli, že extrakt z Escherichia coli převádí polyuridylát (poly U) na polyfenylalanin. To byla nejvíce vzrušující zpráva na kongresu, po kterém vyšlo najevo, že se otevírá velké pole pro experimenty ve studiu genetického kódu. V následujících měsících začal závod mezi laboratořemi Ochoa a Nirenberg, aby studoval účinek různých kopolymerů na kombinaci aminokyselin. Výpočtem statistické konstrukce tripletů v heteropolymerech bylo možné určit jejich poměr pro většinu aminokyselin [29] [30] . Peter Lengiel, Joe Speyer, Wendy Stanley a Albert Wabha byli zapojeni, ale Ochoa osobně vedl projekt a technické zdroje fakulty byly věnovány výhradně syntéze tolika sloučenin, které dekódovací práce potřebovala.

Netrvalo tedy dlouho identifikovat triplety kódující každou z 20 aminokyselin, ani netrvalo dlouho ukázat, že kód byl v mnoha případech obrácený, některé triplety kódují stejné aminokyseliny. Tripletová sekvence definující aminokyseliny byla stanovena Phillipem Lederem a Marshallem Nirenbergem po objevu, že specifické sekvence tripletů bází usnadnily vazbu specifických aminoacyl-tRNA na ribozom. To bylo oznámeno na mezinárodním kongresu biochemie v New Yorku v roce 1964. Chemickou izolací odpovídající mRNA byl kód pro aminokyseliny krásně potvrzen Gobinem Khoranem pomocí syntézy a transkripce oligooxyribonukleotidů pomocí RNA polymerázy. Terminální triplety byly nalezeny v původních genetických experimentech Sidneyho Brennera v Cambridge a Garena v Yale. Marker z Cambridge objevil, že AUG je kodon, který iniciuje řetězec. Laboratoř Severo Ochoa pomocí polynukleotidů začínajících na AUG nebo jiném kodonu připraveném polynukleotidovou fosforylázou určila, že směr čtení byl 5' až 3' [31] [32] . Také in vitro určil , že UAA je jedním z terminálních kodonů [33] .

Iniciační geny pro syntézu proteinů

Tři skupiny najednou - Margarita Salas a Stanley v Ochoa, Eisenstadt a Bravermann a Revel s Grossem zjistili, že přirozená mRNA, jako MS2 a QB bakteriofágů, je přenášena nečištěnými ribozomy Escherichia coli a ribozomy promytými 0,5 nebo 1 M síranem amonným nejsou přenášeny.. Promyté ribozomy však snadno tolerují polyA nebo polyU, ale ne polymery začínající AUG, které se chovají jako přirozené mRNA. Bylo zjištěno, že síran amonný vyplavuje zde obsažený proteinový gen, nazývaný „iniciační gen“, nezbytný pro přenos přirozené mRNA nebo polynukleotidů počínaje AUG [34] [35] . První dva geny a později i třetí byly izolovány a nyní se nazývají IF1, IF2 a IF3 [36] . Clarke a Marker zároveň ukázali, že polypeptidové řetězce bakterií začínají specifickým methyl-tRNAfMet, který esterifikuje methionin, který se naopak produkuje a nachází v polypeptidovém řetězci na koncové aminové pozici. Methyl-tRNAfMet je kódován AUG a prolongátor methyl-tRNAfMet nemůže být produkován specifickou formylázou. Pochopení rolí IF1 a IF3 a sledu událostí vedoucích k iniciaci tvorby komplexu v E. coli bylo kontroverzní a diskutované, dokonce i v Ochoově skupině. Nyní je to jasné díky výzkumu mnoha vědců.

Na počátku 70. let Ochoa přešel ke studiu iniciace translace u eukaryot [37] . Richard Sweet byl prvním, kdo objevil iniciační geny u eukaryot v roce 1968. Analogy IF2 byly poté izolovány v několika laboratořích (Daniel Levin, Theo Staelin, Naba Gupta). eIF2, jak se nyní nazývá, se skládá z řetězce tří polypeptidů a jeho funkcí je tvořit třísložkový komplex GTP a tRNA iniciátoru methyl-tRNA, který neprodukuje methionin. Tato tRNA je však oddělená od methyl-tRNA prolongátoru. V přítomnosti 40S ribozomových podjednotek dává ternární komplex vzniknout 40S iniciačnímu komplexu. Ve stejné době jako některé další skupiny (Londýn, Wurma) Ochoa a de Haro izolovali proteinový gen, který nazvali ESP [38] ; tento protein měl mnoho jmen v závislosti na skupině, která jej objevila, ale nyní se nazývá EiF2B. Jeho způsob působení byl vysvětlen mnohem později. Katalyzuje směnnou reakci mezi GTP a GDP, izoluje GDP a nahrazuje jej GTP. eIF2B byl izolován při práci na úloze hemu v syntéze globinu pomocí lyzátu retikulocytů. Hem zabraňuje fosforylaci malých podjednotek eIF2α specifickou kinázou [39] . Když je eIF2a fosforylován, váže se stabilně do ternárního komplexu a zabraňuje uvolnění eIF2B z katalyzované výměnné reakce. Mechanismus spočívá v tom, že eIF2B je větší než eIF2, takže pouze částečná fosforylace eIF2 je dostatečná k zabránění působení eIF2B jeho izolací.

RNA replikace viru

Severo Ochoa se zajímal o enzym odpovědný za syntézu RNA v genomu virové RNA, a když Charles Weissman v roce 1961 přišel na jeho fakultu, navrhl, aby se ujal replikace RNA. Weissmann nejprve spolu s Joe Krakowem začal studovat replikaci RNA viru tabákové mozaiky ve špenátových listech, ale brzy přešel na E. coli infikované f2 nebo MS2 RNA [40] . Ochoa se o práci vždy zajímal, ale sám se na ní nepodílel. K Weissmanovi se v různých dobách připojilo mnoho vědců, například Martin Billeter, Roy Burdon a Peter Borst. Soutěžilo se mezi skupinami Weissman, Spiegelman a August. Vysvětlení mechanismu syntézy virové RNA bylo obtížným úkolem, protože enzym nebyl rozpustný. Nejlepší volbou byl nakonec virus Qβ. Qβ-RNA polymeráza byla purifikována do homogenního stavu a byla prokázána specifická omezení pro templát Qβ-RNA. V roce 1968 se všechny tři skupiny setkaly a dospěly ke společnému závěru o mechanismu replikace RNA. V první fázi se na kladném řetězci matrice vytvoří záporný řetězec a meziprodukt má otevřenou strukturu. Šablona a produkt netvoří dvojitou šroubovici, ale během replikace drží pohromadě. Struktura se zhroutí uvnitř dvouvláknové struktury pouze tehdy, když jsou proteiny extrahovány. Ve druhé fázi replikace je negativní vlákno použito jako templát pro syntézu kladného vlákna. Tento komplex je podobný prvnímu, pouze matice po celé délce je mínusový řetězec.

Poslední roky

V létě 1974 odešel devětašedesátiletý Ochoa do důchodu z děkanského křesla Biochemické fakulty. Měl nabídku nastoupit do Rocher Institute for Molecular Biology v Nutley. Přijal to a až do roku 1985 pokračoval v práci na výměnném genu GTP/GDP u eukaryot a na roli fosforylace při eukaryotické iniciaci u J. Sikerky. V roce 1985 se s Carmen vrátil do Španělska, kde nadále působil jako čestný ředitel Centra molekulární biologie na univerzitě v Madridu. Centrum bylo založeno pod jeho vedením a nyní je jedním z předních center molekulární biologie. Smrt Carmen v roce 1986 ho zdrtila a z tohoto šoku se nikdy nevzpamatoval, protože ztratil smysl života. Zemřel sedm let poté, v listopadu 1993 v Madridu. Pohřbili ho v Luarce, městě, kde se narodil.

Závěr

Život Severa Ochoa je poučný a lze jej považovat za shrnutí celé historie moderní biochemie. O své práci ve skupině rád mluvil, neměl s tím žádná tajemství. Jakmile se stal biochemikem, začal se učit, a proto byl v mnoha laboratořích. Jak sám řekl, o stálé místo se nebál a celou dobu se divil. Na první místo se štábem zaměstnanců přišel až ve věku 39-40 let. Biochemie byla jeho koníčkem [41] , ale Carmen se ve svém životě snažila najít rovnováhu mezi prací a volným časem. Carmen také zřejmě může za to, že on, kdo miluje hudbu, málokdy vynechal koncerty. Miloval také umělecké výstavy, divadlo a dobré restaurace. Ochoa měl vždy aristokratické chování a chování evropského gentlemana a byl zřídka napjatý, ale vždy neochvějný v konfliktech, které vznikaly při interpretaci výsledků, psaní prací a upřednostňování spisovatelů. Jako každý patriarcha byl velmi rozrušený, když jeho nejlepší studenti a zaměstnanci vyletěli zpod jeho křídel do nezávislého života. Navzdory skutečnosti, že se stal americkým občanem a užíval si života v této zemi, zachoval si zvláštní lásku ke Španělsku a téměř vždy měl ve své skupině Španěla. Tato láska byla vzájemná: ačkoli žil v zahraničí, byl nepochybně jedním z nejslavnějších lidí ve své zemi. Většina španělských měst má ulici, která nese jeho jméno, jeho portrét je k vidění v restauraci v Madridu, kam rád chodil, ve Valencii je muzeum, které vytvořil jeho kolega Santiago Grisolia, a jeho obraz je v muzeu voskových figurín v Barceloně. . Dal podnět ke kariéře mnoha svých studentů, od Arthura Kornberga po Charlese Weissmana, z nichž mnozí se stali slavnými vědci.

Severo Ochoa získal řadu ocenění. Byl členem Americké národní akademie věd, Americké akademie věd a umění, zahraničním členem Královské společnosti v Londýně a zahraničním členem Akademie věd SSSR. Měl 36 čestných doktorátů a přes sto medailí a cen. V letech 1961 až 1967 byl také prezidentem Mezinárodní unie biochemiků a v roce 1959 obdržel Nobelovu cenu.

Memoáry Marianne Grünberg-Manago [6]

Severo Ochoa jsem poprvé potkal v roce 1952 v Paříži na druhém mezinárodním biochemickém kongresu. Vysoký a pohledný, tehdy mu bylo 47 let; vypadal jako španělský Hidalgo s divoce hnědýma očima a chuchvalcem bílých vlasů. Na Sorbonně udělal Ochoa silný dojem svou jasnou a informativní přednáškou o fixaci CO2 během oxidace substrátu, ukazující krásné krystaly kondenzovaného enzymu. Jeho jméno bylo dobře známé ve Francii, ale hlavně z literatury, protože Evropa se teprve vzpamatovávala z války a mezinárodních setkání bylo málo. Byla to moje první taková konference, takže jsem měl obavy. Jako postgraduální student jsem si uvědomil, že chci provést svůj výzkum v jeho laboratoři, a můj vedoucí Jevgenij Abel mě s ním seznámil. Severo Ochoa mluvil plynně francouzsky a byl jsem šokován, když schválil můj přestup k němu na Newyorskou univerzitu a naplánoval začátek na září 1953. Dohodli jsme se, že nejprve strávím pár měsíců v laboratoři Irvinga Gonzala v Urbaně. Ochoa byl velmi potěšen, že získal postgraduálního studenta a že obdivuji práci Gonzala. Ten plán schválil.

Když jsem v září 1953 po několika měsících enzymologického školení v laboratoři Gonzalus dorazil do laboratoře Severo Ochoa, byla ještě ve staré budově (přestěhovala se do nové v létě 1954). Byl jsem zklamaný, zvláště při vstupu do laboratoře jsme museli projít anatomickou místností, kde studenti medicíny pitvali mrtvoly. V laboratoři však panovala velmi přátelská atmosféra: byla přeplněná, ale velmi dobře organizovaná. Pokoje byly vybaveny vším potřebným, aby se každý cítil nezávislý a spokojený. Morton Schneider, hlavní technik, a Peter Lozina měli na starosti pilotní závod, a pokud jste měli problém, vždy jste se mohli obrátit na Mortona, který jej rychle vyřešil. Skupina byla poměrně malá: Joe Stern, Alice del Campillo, Seymour Kaufman a Řek s diplomem S. Alvisatos. Také na fakultě, i když dost odděleně, byl Charlie Gilvard, který se zabýval lysinem a studoval diaminy. Měl nejkritičtější a nejnápaditější myšlení. Sarah Ratner byla také nezávislou vědkyní pracující na enzymatických krocích Krebsova cyklu močoviny. Později přišli Martin Flavin a Bill Jacobi, kteří pracovali s mravenčí hydrogenázou. Ve stejnou dobu jako já se objevil další postgraduální student Ernie Rose. Severo Ochoa obvykle přicházel v 9 a končil v 7 a dveře jeho kanceláře byly téměř vždy otevřené. V Británii se naučil produktivně pracovat, aniž by tím trávil spoustu času. Každý den experiment probíral s různými skupinami. Když jsem přišel do laboratoře, byla v ní tradice, kterou se Ochoa snažil dodržet, aby se všichni sešli u oběda a každý, jak je v Americe zvykem, se svým chlebíčkem. Tato událost se odehrála v jedné z místností laboratoře. Mně a Erniemu to připadalo nudné a formální a rozhodli jsme se oddělit se od ostatních a jít do kavárny. O dva dny později nás Ochoa chytil a zeptal se: "Proč tě nemůžu vidět na obědě?". Odpověděli jsme, že raději chodíme do kaváren a že už jsme unavení z chlebíčků, na což on odpověděl: „Jak cool, můžu jít s tebou?“. Od toho dne jedl s námi a pak se přidali i ostatní. Atmosféra v laboratoři se, jak už to někdy bývá, zcela změnila: stala se neformální, uvolněnou, prosycenou výměnou informací o vědeckých i světských záležitostech. Rozhovory byly velmi zajímavé: někdo se mohl ptát nebo vymýšlet techniku ​​a já jsem obdivoval Ochoovu schopnost vytvořit během těchto obědů vysoce vědeckou a klidnou atmosféru. V sobotu jsme chodili do různých restaurací a v poledne byla také přestávka na kávu a dorty, kde jsme mohli pokračovat v diskuzích.

Před mým příjezdem byla laboratoř vybavena pro práci s izotopy. Mechanismus reakce P-enzymu byl rychle pochopen studiem výměnné reakce mezi 32-fosforem značeným ADP nebo ATP a sukcinátem značeným sukcinyl-CoA. Tyto studie ukázaly fosforylační meziprodukty a vedly k pochopení detailů reakčního mechanismu. Použitá metoda byla velmi slibná a Severo Ochoa ji chtěl aplikovat na další reakce zahrnující fosforylaci. Zejména věřil, že nadešel čas studovat klíčový a základní problém doby: syntézu ATP, ke které dochází během oxidativní fosforylace. Problémem mechanismu tohoto procesu se zabývaly nejprestižnější a nejrozsáhlejší skupiny (Green, Boyer, Lehninger , Dardy, Rucker, Conn), které spolu soupeřily. Než Severo Ochoa svěřil proces svým novým vědcům (Erniemu a mně), musel otestovat naši schopnost čistit enzymy a studovat jejich vlastnosti. Nechal nás tedy začít dalším problémem, který ho zajímal: mechanismem fosforylace acetátu acetokinázou (bez CoA jako meziproduktu):

acetát + ATP ↔ acetyl PO4 + ADP.

Dal nám láhev sušené E. coli a my jsme si uvědomili, že musíme pracovat na čištění a mechanismu pro acetokinázu s tím, co v ní bylo. V té době ještě nebyly vyvinuty techniky produktivní frakcionace proteinů, jako je výměna náboje a chromatografie na Sephadexu. Purifikace sestávala z frakcionace solí v organickém rozpouštědle při nízké teplotě a eluce z různých gelů, jako je fosforečnan vápenatý. Pamatuji si, kolik buněk E. coli jsme promarnili, než jsme se naučili, jak správně provést tento postup. Dále jsme studovali mechanismus, který zahrnuje současnou vazbu fosfátového donoru a akceptoru enzymem v semenech po výměně fosfátu enzymem [25] . Žádný fosforylovaný meziprodukt se na mechanismu nepodílel a mechanismus na nás moc nezapůsobil, ale školení v čištění a enzymologii pro nás bylo užitečné a enzymy byly potřeba. Na návrh Terri Stadtman, která nějakou dobu pracovala v laboratoři, jsem vyvinul postup pro stanovení acetátu pomocí acetokinázy a Terri pak tuto metodu použila pro některé své studie [25] .

Rád vzpomínám na období spolupráce s Ernie Rose. Úspěšně jsme prošli zkušební dobou a kolem Vánoc se nám Severo Ochoa rozhodl svěřit svůj „projekt snů“ – oxidativní fosforylaci. Ernie Rose se rozhodl to otestovat na krysích mitochondriích. Jelikož byl fascinován prací Paula Boyera a Milreda Cohna o výměně izotopů 18O, chtěl tuto metodu aplikovat na svůj výzkum. Nechtěl jsem zabíjet krysy a rozhodl jsem se proces studovat na bakteriích. Rozhodl jsem se, že výběrem specificky aerobních bakterií, jako je Azotobacter vinelandi, které aktivně oxidují sacharidy, bych mohl lépe izolovat aktivní systém pro syntézu ATP spojený s oxidací. Uvědomil jsem si, že by bylo obtížné detekovat příjem čistého PO4 v bakteriálních extraktech kontaminovaných fosfáty a různé reakce doprovázející jejich příjem nebo uvolňování, rozhodl jsem se použít výměnnou reakci mezi PO4 a ATP (dobře zběhlý po studiu acetokinázy) jako metoda izolace některých zajímavých nových fosforylovaných koenzymů. Myšlenka, nyní zdánlivě naivní, byla, že reakce zahrnující rozpustný koenzym X, který by byl během syntézy ATP fosforylován specifickým enzymem, by byla velmi jednoduchá:

ATP + X ↔ XP + ADP ↔ ADP + P + X.

Samozřejmě jsem pozoroval výměnu mezi 32PO4 a dvěma koncovými fosfátovými skupinami ATP v roztoku extraktu Azotobacter vinelandi a začal jsem čistit protein zodpovědný za výměnu. Jako substrát jsem použil komerční amorfní ATP. Během této práce Sigma oznámila velmi čistý krystalický derivát ATP, který právě připravila. Podařilo se mi získat část této látky a ke svému překvapení jsem již nepozoroval výměnnou reakci s krystalickým derivátem v přítomnosti proteinové frakce, kterou jsem částečně vyčistil. Tato skutečnost nás ale i Severa Ochoa potěšila, protože jsme doufali, že amorfní přípravek obsahuje zajímavý kofaktor. Rozhodl jsem se izolovat frakci z amorfního přípravku, který po přidání ke krystalickému ATP znovu nastartoval metabolismus. Jaké bylo moje překvapení, když chromatografie identifikovala tuto látku jako ADP. Ve skutečnosti byl ATP pouze značen, protože adenylátkináza stále kontaminovala proteinovou frakci (je známo, že je velmi obtížné zbavit se stop adenylátkinázy). Měl jsem to na paměti, když jsem o tomto objevu řekl skupině u oběda. Nikdo mi nevěřil a Severo Ochoa mě praštil, že to není možné, ale pak toho litoval, a když jsem přišel do laboratoře, mohl jsem ho snadno přesvědčit, že skutečným substrátem ve výměnné reakci je ADP. . Byl šokován, protože nikdo nevěděl o enzymu schopném takovou výměnu katalyzovat, a souhlasil s mou snahou pokusit se pochopit, co je za to odpovědné v této reakci. Brzy jsem zjistil, že tento enzym není specifický pro ADP, ale katalyzuje výměnu s jinými difosfátovými nukleotidy (UDP, CDP, GDP a IDP).

V létě 1954 se Severo Ochoa stal děkanem biochemické fakulty a přestěhoval se do nové budovy naproti přes ulici. Bylo tam více místa, v suterénu byl pilotní závod, který vedli Morton Schneider a Peter Lozina; tam bylo také pohodlnější pracovat s radioaktivními izotopy. Seymour Kaufman, Joe Stern a Alice del Campillo skupinu opustili, zatímco Bill Jacobi, Martin Flavin a Charles Gilward zůstali; novými zaměstnanci byli Gegard Plaut a Enrico Cutolo. Zde jsme měli více zařízení na oběd a navštěvovalo nás více lidí. Je čas na ještě aktivnější a veselejší chvíle. Ale po prvním vzrušení z objevování nové reakce jsem strávil několik neuspokojivých měsíců ve snaze udělat nějaký pokrok. Během této doby mi Severo Ochoa z celého srdce poskytl podporu a povzbuzení v mém úsilí o další čištění enzymu. Udělal jsem to, ale stále jsem nemohl identifikovat reakci: bylo to, jako když máte proteinový krystal, ale nemůžete rozpoznat samotný krystalizující protein. Během výměny se uvolnilo určité množství fosfátu, ale to bylo přičítáno zbytku kontaminace fosfatázou. Severo Ochoa začínal být sklíčený, že v té době Pinchot izoloval různé frakce z Alcaligenes faecalis, které po smíchání katalyzovaly příjem čistých fosfátových skupin následovaný přenosem elektronů. Začal zpochybňovat hodnotu výměny a schválil můj pokus znovu vytvořit Pinchotův experiment s extraktem z Azotobacter vinelandi. Vzpomněl jsem si, že nás navštívil Pinchot a dělal pokusy v naší laboratoři. Nebyl jsem však připraven problém okamžitě řešit. Zejména mě zarazilo malé uvolnění fosfátu, zatímco jsem s jistotou věděl, že enzym je dobře vyčištěný od fosfatázy, a rozhodl jsem se vypátrat příčinu tohoto jevu.

V této době šel Severo Ochoa do Evropy (myslím, že obchodně související s Mezinárodní biochemickou unií). Slíbil jsem mu, že pokud nebudu mít žádné výsledky, než se vrátí, začnu znovu hledat malé uvolnění PO4 v extraktech z Azotobacter vinelandi. Provedl jsem jednoduchý experiment, který byl rozhodující pro objev polynukleotidové fosforylázy: ADP jsem nahradil inosindifosfátem (IDP). Adenylátkináza je neaktivní vůči inosinovým derivátům, a tak jsem se vyhnul složitosti mono- a triderivátů tvořených adenylátkinázou a vynesl jsem saturační křivku. Difosfáty bylo těžké sehnat a byly drahé a já jsem musel ospravedlnit jejich použití pro něco, co vypadalo jako triviální experiment. V nasyceném stavu (polynukleotidfosforyláza má nízkou afinitu k difosfátovým derivátům) jsem však zjistil výrazné uvolnění fosfátových skupin. Bylo mi útěchou, když jsem si uvědomil, že mám co do činění nejen s výměnnou reakcí, ale také s reakcí, která produkuje PO4. Okamžitě jsem začal chromatograficky identifikovat další reakční produkt. Z této strany je stále zajímavá reakce hydrolýzy difosfátu na monofosfát. Ve stejné době na fakultě pracoval Gegard Plaut, který studoval IDP-ázu, kterou izoloval z mitochondrií krysích jater, ale reakce v mém případě vypadala vratně a reverzibilita hydrolytických reakcí se zdála nepravděpodobná. Chromatografie reakční směsi na koloně Dowess ukázala tvorbu IMP, což mě potěšilo, ale zpočátku jsem nemohl identifikovat žádné nové produkty v eluátu z kolony. Na základě toho mohla být syntetizovaným enzymem sloučenina, která nebyla za podmínek tohoto experimentu eluována. Začal jsem doufat, aniž jsem tomu úplně věřil, že produkt, který se usadil v koloně, může být sloučenina s vysokou molekulovou hmotností. Naštěstí se mi pomocí chromatografického papíru po enzymatické inkubaci podařilo v reakční směsi identifikovat čerstvou skvrnu ultrafialového světla, která nepocházela ze začátku chromatogramu, a uvědomil jsem si, že výsledným enzymem je polynukleotid. Nikdy nezapomenu na den, kdy jsem viděl nový spot – byl jsem tak zaplaven emocemi, že jsem chtěl o události říct všem, kdo byli v laboratoři, ale ke svému zklamání, jako v případě Severo Ochoa s kondenzačním enzymem , nikdo tam nebyl - Byly prázdniny. Nakonec jsem Severovi zavolal domů; byl ohromen tím, co se stalo. Objev ho samozřejmě potěšil, ale v hloubi duše stále doufal, že syntetizovaný produkt má pyrofosfátovou vazbu a nějak souvisí s oxidativní fosforylací. To dobře ilustruje, jak daleko byly zájmy tehdejších enzymologů od molekulární biologie. Enzymologii nukleových kyselin pak studovaly na jiných místech malé skupiny, nejčastěji Angličané (Markham, Piri, Kalkar). Myslím, že během prvního roku v New Yorku jsem slovo "nukleová kyselina" nikdy neslyšel. Ale brzy jsme byli tímto zjištěním šokováni. Severo Ochoa mi řekl, že na semináři o P-enzymu v Bezesdě se na konci krátce zmínil o objevu (strukturu polymeru jsme ještě nepochopili) a viděl, jak ospalý je celý seminář, když se Kalkar najednou probudil, skočil do křesla!

S pomocí Leona Heppela, Jacqua Fresca a Alexe Riche se výsledky dostavily rychle. Podařilo se mi ukázat, že se produkt vysrážel kyselinou (to byl další úžasný okamžik: viděl jsem, jak polymer vytvořil pevný gel; myslím, že v té době byl Jacques Fresco) a zjistil jsem, že polymer má vysokou molekulovou hmotnost, což jako první určil Alex Rich. Brzy jsem zjistil, že polymer má dvě esterové skupiny. Leon Heppel měl k dispozici všechny enzymy potřebné ke studiu struktury hmoty a se svou obvyklou velkorysostí nám dal vše, co jsme potřebovali [26] . Pomocí směsi adenosinu, uridinu, cytosinu a guanosindifosfátů jsem byl schopen syntetizovat kopolymer podobný RNA, který obsahoval čtyři báze [27] .

Diskutovali jsme o tom, jak pojmenovat enzym. Severo Ochoa doufal, že by se mohl in vivo podílet na nějakém druhu (snad v přítomnosti primeru) syntéze polynukleotidů, a přikláněl se k tomu, že to bude nazývat RNA syntetáza. Já jsem zase věřil, že se enzym podílí na rozkladu RNA, a věřil jsem, že by bylo správnější nazývat ho fosforyláza. Nakonec mi Severo řekl: "Marianne, protože tě moc miluji, přijímám tvé jméno."

Práci jsem prezentoval na setkání Federace společností pro experimentální biologii v San Franciscu v roce 1955. Pamatuji si, že sál byl před mým projevem docela prázdný a zaplnil se do posledního místa přímo před ním (fáma o otevření se už rozšířila). Práce vzbudila značný zájem: šlo o první případ extracelulární syntézy makromolekulární látky podobné RNA. Objev polynukleotidfosforylázy dal velký impuls výzkumu biochemiků po celém světě: donutil jsem je studovat nejen intermediární metabolismus a oxidativní fosforylaci, ale i další procesy. To je inspirovalo ke studiu enzymů, jako jsou RNA a DNA polymerázy, zodpovědné za syntézu nukleových kyselin. Biochemici se začali zajímat o syntézu proteinů a nukleových kyselin. To umožnilo laboratořím Paula Dotyho, Alexe Riche, Jacqua Fresca a Garyho Felsenfelda zkoumat strukturu DNA a RNA. Vzhledem k nízké specifitě enzymů s nimi mohly být syntetizovány různé polymery, což vedlo k modernizaci techniky syntézy laboratoří Doty. V době mého objevu byla struktura DNA objasněna Watsonem a Crickem, ale asi nejsilnější význam měl její použití při dešifrování genetického roku (viz níže). Pro biochemiky nastalo nové období – období formování molekulární biologie. Objev byl oceněn Nobelovou cenou za medicínu v roce 1959 [28] . Cena byla sdílena s Arthurem Kornbergem za jeho práci na DNA polymeráze. Severo Ochoa mi nabídl práci a poradil mi, abych zůstal v USA, kde jsem měl více příležitostí než ve Francii, jako příklad uvedl svou kariéru, ale nakonec jsme se s manželem rozhodli vrátit do Francie, zejména proto, že jsem čekala dceru .

Když jsem se vrátil, pracoval jsem na struktuře enzymu a jeho roli in vivo . Bylo to těžší, než se zpočátku zdálo. Nyní ze studií mnoha vědců je jasné, že se podílí na rozkladu mRNA, a to jak odstraněním messenger RNA, tak poskytnutím prekurzorů pro syntézu RNA a DNA. Jsem Severovi Ochoovi vděčný za zkušenosti, které jsem získal při práci v jeho laboratoři, i za atmosféru, která v ní vládne a kterou dokázal vytvořit. Doposud mám mnoho přátel a známých vědců z jeho laboratoře a všichni se cítíme jako součást rodiny Severo Ochoa.

Poznámky

  1. ↑ 1 2 Severo Ochoa // Encyclopædia Britannica 
  2. ↑ 1 2 Severo Ochoa // Encyklopedie Brockhaus  (německy) / Hrsg.: Bibliographisches Institut & FA Brockhaus , Wissen Media Verlag
  3. ↑ 1 2 Severo Ochoa de Albornoz // Gran Enciclopèdia Catalana  (kat.) - Grup Enciclopèdia Catalana , 1968.
  4. ↑ https://sevilla.abc.es/sevilla/sevi-casi-siglos-formacion-cientifica-y-humanistica-instituto-san-isidoro-sevilla-201805130843_noticia.html
  5. ↑ Informace na stránkách Nobelova výboru Archivováno 2. února 2007 na Wayback Machine 
  6. ↑ 1 2 Biogr. Mems Fell. R. Soc. sv. 43 351-365. (1997)
  7. ↑ MIKRO METODA PRO ODHAD CELKOVÉHO KREATININU VE SVALU
  8. ↑ (S JG Valdecasasem) Mikrometoda pro stanovení kreatininu ve svalu J. Biol Chem. 81, 351-357. (1929)
  9. ↑ (S R.A. Petersem) Vitamin B1 a karboxyláza ve tkáních zvířat. Biochem. J. 32, 1501-1515 (1938)
  10. ↑ (S I. Bangou a R.A. Petersem) Oxidace pyruvátů v mozku. VII. Některé dialyzovatelné složky oxidačního systému pyruvátu. Biochem. J. 33, 1980-1996. (1939)
  11. ↑ Spojení fosforylace s oxidací kyseliny pyrohroznové a mozku. J Biol Chem. 138, 751-773 (1941)
  12. ↑ Účinnost aerobní fosforylace v bezbuněčných extraktech. J Biol Chem. 151, 493-505 (1943)
  13. ↑ Biosyntéza trikarboxylových kyselin fixací oxidu uhličitého. III. Enzymatické mechanismy. J Biol Chem. 174, 133-157 (1948)
  14. ↑ (S A. H. Mehlerem & A. Kornbergem) Biosyntéza dikarboxylových kyselin fixací oxidu uhličitého. I. Izolace a vlastnosti enzymu z jater holubů kayalyzujícího reverzibilní oxidativní dekarboxylaci kyseliny I-jablečné. J Biol Chem. 174, 979-1000.
  15. ↑ (S W. Vishniacem) Fotochemická redukce pyridinových nukleotidů špenátovým grana a spřažená fixace oxidu uhličitého. Nature 167, 768-769 (1951)
  16. ↑ (S JR Sternem a MC Schneiderem) Enzymatická syntéza kyseliny citrónové. II. Krystalický kondenzační enzym. J Biol. Chem. 193, 691-702
  17. ↑ (S JR Stern & E Lynen,) Enzymatická syntéza kyseliny citrónové. V. Reakce acetylkoenzymu AJ Biol. Chem. 198, 313-321 (1952)
  18. ↑ (Se S. Korkem & A. del Campillo) Biosyntéza dikarboxylových kyselin fixací oxidu uhličitého IV. Izolace a vlastnosti adaptivního jablečného enzymu z Lactobacillus arabinosus. J Biol Chem. 187, 891-905. (1950)
  19. ↑ Stern, JR, Coon, MJ, del Campillo, A. & Schneider, MC 1956 Enzymy metabolismu mastných ecidů. IV. Příprava a vlastnosti koenzymu a transferázy. J Biol. Chem. 221, 15-31
  20. ↑ (S M. Flavinem) Metabolismus kyseliny propionové v živočišných tkáních. I. Enzymatická konverze propionátu na sukcinát. J Biol. Chem. 229, 965-979 (1957)
  21. ↑ (S M. Flavinem & H. Castro-Mendozou) Metabolismus kyseliny propionové v živočišných tkáních. II. Propionyl koenzym A karboxylační systém. J Biol. Chem. 229, 981-996
  22. ↑ (S Y. Kaziro & E. Leone) Biotin a propionylkarboxyláza. Proč. Natn. Akad. sci. USA 46, 1319-1327. (1960)
  23. ↑ (Se S. Kaufmanem, C. Gilvargem & O. Cori) Enzymatická oxidace a-ketoglutarátu a párová fosforylace. J Biol. Chem. 203, 869-888. (1953)
  24. ↑ Kaufman, S. Studie mechanismu reakce katalyzované fosforylačním enzymem. J Biol. Chem. 216, 153-164. (1955)
  25. ↑ 1 2 3 (S IA Rose, M. Grunberg-Manago & SR Korey) Enzymatická fosforylace acetátu. J Biol. Chem. 211, 737-756. (1954)
  26. ↑ 1 2 (S M. Grunberg-Manago) Enzymatická syntéza a rozklad polynukleotidů; fosforylázový polynukleotid. J. Am. Chem. soc. 77, 3165-3166. (1955)
  27. ↑ 1 2 (S M. Grunberg-Manago & PJ Ortiz) Enzymatická syntéza polynukleotidů. I. Polynukleotidová fosforyláza z Azotobacter vinalandii. biochim. Biophys. Acta 20, 269-285. (1956)
  28. ↑ 1 2 Nobelovy přednášky 1959. Stockholm, pp. 146-164.
  29. ↑ (S P. Lengyelem a JF Speyerem) Syntetické polynukleotidy a kód aminokyselin Proc. Natn. Akad. sci. USA 47, 1936-1942.
  30. ↑ Lengyel, P. 1962 Využití syntetických polynukleotidů při dešifrování genetického kódu. PhD práce. New York University. J Biol Chem. 216, 153-164.
  31. ↑ (S M. Salas, MA Smith, WM Stanley Jr & AJ Wahba) Směr čtení genetické zprávy. J Biol Chem. 240, 3988-3995. (1965)
  32. ↑ (S MA Smith, M. Salas, WM Stanley Jr & AJ Whaba) Směr čtení genetické zprávy. Proč. Natn. Acad.Sci. USA 55, 141-147
  33. ↑ (S JA Last, WM Stanley Jr., M. Salas, MB Hille & AJ Wahba) Překlad genetické zprávy, IV UAA jako kodon pro ukončení řetězce. Proč. Natn. Akad. Sci USA 57, 1062-1067
  34. ↑ (S WM Stanley Jr, M. Salas & AJ Wahba) Překlad obecné zprávy: Faktory podílející se na zahájení syntézy proteinů. Proč. Natn. Akad. sci. USA 56, 290-295. (1966)
  35. ↑ (S M. Salasem, MB Hille, JA Last & AJ Wahbou) Překlad zprávy genetického kódu. II. Vliv iniciačních faktorů na vazbu formyl-methionyl-tRNA na ribozomy.Proc. Natn. Acad. Sci USA 57, 387-394. (1967)
  36. ↑ (S K. Iawasaki, S. Sabo & AJ Wahba) Překlad genetické zprávy. VII. Role iniciačních faktorů při tvorbě řetězcového iniciačního komplexu s ribozomy Escherichia coli. Arch Biochem. Biophys. 125, 542-547. (1968)
  37. ↑ (S M. Zasloffem) Iniciace polypeptidového řetězce u eukaryot. IV. Purifikace a vlastnosti supernatantového iniciačního faktoru z embryí Artemia salina. J. Mol. Biol. 73, 65-76. (1973)
  38. ↑ (S C. de Haro) Další studie o způsobu účinku hemem kontrolovaného translačního inhibitoru. Proč. Natn. Akad. Sci USA 76,1741-1745. (1979)
  39. ↑ (S A. Dattou, C. de Haro & JM Sierrou) Mechanismus translační kontroly heminem v lyzátech retikulocytů. Proč. Natn. Akad. Sci.USA 74, 3326-3329. (1977)
  40. ↑ Weismann, C. 1976 In Úvahy o biochemii (ed. A. Kornberg, BL Horecker, L. Cornudella & J. Oro), pp. 283-292. New York: Pergamon.
  41. ↑ Honba za koníčkem. L. Rev. Biochem., 491-530. (1980)

Odkazy

  Přejděte na položku Wikidata  Tematické stránky
Slovníky a encyklopedie
Genealogie a nekropole