Dot blotting

Dot blot  je technika používaná v molekulární biologii k detekci různých makromolekul, jako jsou nukleové kyseliny nebo proteiny. Tato technika je určitým zjednodušením Western blotu : vzorky obsahující studované makromolekuly jsou okamžitě aplikovány na nitrocelulózovou nebo PVDF membránu, čímž se obejde fáze předběžné elektroforézy v PAAG (zejména při práci s proteiny).

Protokol pro práci s PVDF membránou

  1. Naneste zkušební vzorky na suchou PVDF membránu (1-3 µl roztoku na bod). Při práci s PVDF membránou musí mít pufr, ve kterém jsou vzorky rozpuštěny, dostatečně vysokou iontovou sílu , jinak se roztok jednoduše nemusí dostat do membrány kvůli svým hydrofobním vlastnostem.
  2. Membrána musí být vysušena. Obvykle stačí 30 minut při pokojové teplotě.
  3. Umístěte membránu do pufru, abyste snížili nespecifické vazby protilátek. Roli činidla, které snižuje nespecifické interakce, obvykle plní bovinní sérový albumin (BSA) nebo sušené mléko . 20 minut - 1 hodina při pokojové teplotě.
  4. Umístěte membránu do primárního protilátkového pufru. V tomto pufru je také přítomen BSA nebo sušené mléko, ale v menším množství. 1 hodina - ON, T = 4 С°.
  5. Membránu promývejte 3 x 5 min.
  6. Umístěte membránu do pufru obsahujícího sekundární protilátku obsahující detekční činidlo, jako je křenová peroxidáza . 1-2 hodiny při pokojové teplotě.
  7. Membránu znovu promývejte 3 x 5 min.
  8. Umístěte membránu do detekčního roztoku. Je lepší přidat 30% peroxid vodíku do komerčního roztoku (asi 10-50 µl na 10 ml roztoku). 1-3 minuty při pokojové teplotě.
  9. Detekce. V případě použití sekundárních protilátek s křenovou peroxidázou je pozorováno chemiluminiscenční záření způsobené vyříznutím substrátu z detekčního roztoku křenovou peroxidázou. V případě použití přístroje registrujícího chemiluminiscenci stačí velmi malá expozice (do 2 minut).

Viz také