Dot blotting
Dot blot je technika používaná v molekulární biologii k detekci různých makromolekul, jako jsou nukleové kyseliny nebo proteiny. Tato technika je určitým zjednodušením Western blotu : vzorky obsahující studované makromolekuly jsou okamžitě aplikovány na nitrocelulózovou nebo PVDF membránu, čímž se obejde fáze předběžné elektroforézy v PAAG (zejména při práci s proteiny).
Protokol pro práci s PVDF membránou
- Naneste zkušební vzorky na suchou PVDF membránu (1-3 µl roztoku na bod). Při práci s PVDF membránou musí mít pufr, ve kterém jsou vzorky rozpuštěny, dostatečně vysokou iontovou sílu , jinak se roztok jednoduše nemusí dostat do membrány kvůli svým hydrofobním vlastnostem.
- Membrána musí být vysušena. Obvykle stačí 30 minut při pokojové teplotě.
- Umístěte membránu do pufru, abyste snížili nespecifické vazby protilátek. Roli činidla, které snižuje nespecifické interakce, obvykle plní bovinní sérový albumin (BSA) nebo sušené mléko . 20 minut - 1 hodina při pokojové teplotě.
- Umístěte membránu do primárního protilátkového pufru. V tomto pufru je také přítomen BSA nebo sušené mléko, ale v menším množství. 1 hodina - ON, T = 4 С°.
- Membránu promývejte 3 x 5 min.
- Umístěte membránu do pufru obsahujícího sekundární protilátku obsahující detekční činidlo, jako je křenová peroxidáza . 1-2 hodiny při pokojové teplotě.
- Membránu znovu promývejte 3 x 5 min.
- Umístěte membránu do detekčního roztoku. Je lepší přidat 30% peroxid vodíku do komerčního roztoku (asi 10-50 µl na 10 ml roztoku). 1-3 minuty při pokojové teplotě.
- Detekce. V případě použití sekundárních protilátek s křenovou peroxidázou je pozorováno chemiluminiscenční záření způsobené vyříznutím substrátu z detekčního roztoku křenovou peroxidázou. V případě použití přístroje registrujícího chemiluminiscenci stačí velmi malá expozice (do 2 minut).
Viz také