Chromatografie na reverzní fázi

Chromatografie s reverzní fází (reverse-phase) (RPC) je variantou chromatografie , ve které je stacionární fáze nepolární [1] . Tato varianta chromatografie se týká kapalinové chromatografie (na rozdíl od plynové chromatografie).

Termín "obrácená fáze" má historické pozadí. V 70. letech 20. století používala kapalinová chromatografie ve většině případů pevnou stacionární fázi (nazývanou také „ kolona “), která obsahovala nemodifikovaná silikonová nebo hliníková plniva. Dnes je tato metoda známá jako "chromatografie s normální fází". V případě chromatografie s normální fází je stacionární fáze hydrofilní (má vysokou afinitu k hydrofilním molekulám v mobilní fázi). Proto mají hydrofilní molekuly v mobilní fázi tendenci se vázat ( adsorbovat ) na koloně, zatímco hydrofobní molekulymolekuly procházejí kolonou a jsou eluovány jako první. Při chromatografii na normální fázi mohou být hydrofilní molekuly eluovány z kolony zvýšením polarity roztoku mobilní fáze.

Nástup metod využívajících alkylové řetězce kovalentně vázané na pevnou bázi umožnil vytvořit hydrofobní stacionární fázi se silnou afinitou k hydrofobním sloučeninám. Použití hydrofobní stacionární fáze lze chápat jako opak nebo „reverzní“ chromatografii s normální fází – odtud termín „chromatografie s reverzní fází“ [2] [3] . Chromatografie na reverzní fázi využívá polární (vodnou) mobilní fázi. V důsledku toho jsou hydrofobní molekuly v polární mobilní fázi adsorbovány na hydrofobní stacionární fázi, zatímco hydrofilní molekuly v mobilní fázi projdou kolonou a budou eluovány jako první [2] [4] . Hydrofobní molekuly lze z kolony eluovat snížením polarity mobilní fáze pomocí organických (nepolárních) rozpouštědel, která snižují hydrofobní interakce. Čím je molekula hydrofobnější, tím více se bude vázat na stacionární fázi a tím vyšší koncentrace organického rozpouštědla bude zapotřebí k eluci této molekuly.

Mnoho z matematických a experimentálních předpokladů používaných v jiných chromatografických metodách platí také v OFC (např. "rozlišení separace" závisí na délce kolony). Může být také použit k separaci mnoha typů molekul. Tato metoda se běžně nepoužívá k separaci proteinů, protože použitá organická rozpouštědla mohou denaturovat většinu proteinů. Proto je v tomto případě přijatelnější metodou chromatografie na normální fázi.

Dnes se OFC často používá pro analytické účely. Pro RPC existuje řada různých stacionárních fází, což umožňuje větší flexibilitu při výběru separačních metod.

Stacionární (stacionární) fáze

Tabulka 1. Hlavní stacionární fáze používané v HPLC s reverzní fází [5] [6] .
Označení Popis Struktura
Cl, TMS, SAS, trimethyl Má vysokou selektivitu při separaci polárních sloučenin a sloučenin s velkým počtem funkčních skupin. Nejméně ze všech zadržuje sloučeniny s alkylovými skupinami v nepolárních rozpouštědlech.
C2, RP-2, dimethyl Má vyšší retenci než C1 a méně než C4, C8 a C18.
C3, propyl Používá se při hydrofobní interakční chromatografii ( HIC ) peptidů a proteinů.
C4, butyl Použitelné pro HIC a iontovou párovou chromatografii. V nepolárních rozpouštědlech má nižší retenci než fáze C8 a C18. Tento materiál o průměru pórů 300 Á je ideální pro analýzu velkých proteinů a hydrofobních peptidů.
C5, Pentil S průměrem pórů 300 Á se používá pro separaci hydrofobních proteinů a peptidů s reverzní fází. Odolnější vůči hydrolýze než C4.
C6, hexyl Používá se pro iontovou párovou chromatografii. Má nižší retenci než C8 a C18.
C8, MOS, RP-8, LC8, oktyl Selektivita se blíží C18, ale má nižší retenci. Široce se používá při analýze léků, nukleotidů, steroidů atd. S průměrem pórů 300 Á je tento materiál vhodný pro separaci peptidů a malých hydrofilních proteinů.
C12, dodecyl Díky kratšímu uhlíkovému řetězci než C18 poskytuje dobrou interakci a ostřejší tvar píku pro nepolární a středně polární sloučeniny.
C18, ODS, RP-18, LC-18, oktadecyl Klasický materiál s reverzní fází s nejvyšší retencí v nepolárních rozpouštědlech. Funguje skvěle v iontové párové chromatografii. Má nejširší spektrum použití (separace peptidů, nukleosidů, nukleotidů, steroidů, léčiv, vitamínů, mastných kyselin, pesticidů atd.). S průměrem pórů 300 Á se tento materiál používá k separaci malých hydrofobních peptidů.
C6H5 , fenyl _ _ Má jedinečnou selektivitu a používá se k separaci aromatických sloučenin. S průměrem pórů 300 Á se tento materiál používá pro HIC.
C6H5 ( C3H60 linker ) , fenylether _ _ _ Používá se k separaci vysoce polárních aromatických látek. Liší se selektivitou od fenylové a fenylhexylové fáze.
C6H5 ( C6H12 linker ) , fenyl - hexyl _ Má stejnou selektivitu jako fenylová fáze, ale s mnohem větší stabilitou.
C6F5 , PFP _ _ Používá se pro analýzu substituovaných aromatických sloučenin. Liší se selektivitou od fenyl-hexylových, klasických fenylových a alkylových fází.
CN, CPS, PCN, kyano, kyanopropyl, nitril Lze použít jako materiál s reverzní fází nebo normální fází. Jelikož je tato fáze mírně polární, má vynikající selektivitu při separaci polárních sloučenin. Navíc se rychle vyrovnává, což je cenná vlastnost při práci .

v gradientovém elučním režimu. Používá se pro analýzu různých léčiv (například antidepresiv atd.)

NH2 , APS , amino, aminopropylsilyl Lze použít pro chromatografii s reverzní fází, normální fází a iontoměničovou chromatografii (slabý aniontoměnič). Používá se v chromatografii na reverzní fázi k oddělení sacharidů.
OH, diol, glycerol Lze použít jako materiál s reverzní fází nebo normální fází. Když pracuje jako reverzní fáze, používá se při gelové filtrační chromatografii (GFC) peptidů a proteinů.

Mobilní fáze

K eluci analytů z kolony s reverzní fází se používají směsi vody nebo vodných roztoků pufrů a organických rozpouštědel [2] . Organická rozpouštědla musí být mísitelná s vodou. Nejběžnější jsou acetonitril , methanol a tetrahydrofuran (THF). Je také možné použít ethanol nebo isopropanol . Eluce může být provedena izokraticky (směs voda-organické rozpouštědlo se v průběhu celého separačního procesu procentuálně nemění), nebo pomocí gradientu (poměr voda-organické rozpouštědlo se v průběhu procesu mění, obvykle ve směru klesající polarity). Hodnota pH mobilní fáze může mít velký vliv na separaci směsi a může také změnit selektivitu analýzy (pořadí uvolňování analyzovaných sloučenin).

Nabité analyty lze separovat na koloně s reverzní fází pomocí iontových párů (také: interakce iontů). Tato technika je známá jako "reverzní fázová iontová párová chromatografie".

Poznámky

  1. ↑ IUPAC Gold Book internetové vydání: " chromatografie na reverzní fázi ".
  2. ↑ 1 2 3 Akul Mehta. Princip chromatografie na reverzní fázi HPLC/UPLC (s animací  ) . PharmaXChange (27. prosince 2012). Získáno 10. ledna 2013. Archivováno z originálu 15. dubna 2013.
  3. ↑ Já Molnár a C Horvath. Chromatografie polárních biologických látek na reverzní fázi: separace katecholových sloučenin vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií  (anglicky)  // Clinical Chemistry : journal. - 1976. - září ( roč. 22 , č. 9 ). - S. 1497-1502 . — PMID 8221 .
  4. ↑ (Clinical Biochemistry, TWHrubey, 54)
  5. ↑ Fenomenex. HPLC vázané fáze . http://www.phenomenex.com . Získáno 3. září 2017. Archivováno z originálu 3. září 2017.
  6. ↑ Aquilon. Stručný průvodce HPLC . www.akvilon.su _

Odkazy

  Přejděte na položku Wikidata  Slovníky a encyklopedie