Gramova metoda

Aktuální verze stránky ještě nebyla zkontrolována zkušenými přispěvateli a může se výrazně lišit od verze recenzované 16. července 2019; kontroly vyžadují 5 úprav .

Gramova  metoda je metoda barvení mikroorganismů pro výzkum, která umožňuje diferenciaci bakterií podle biochemických vlastností jejich buněčné stěny . Navrhl v roce 1884 dánský lékař Hans Christian Gram .

Bakterie se podle Grama barví anilinovými barvivy  - gencián nebo methyl violeť atd., poté se barvivo fixuje roztokem jódu . Po následném omytí obarveného přípravku alkoholem se ty druhy bakterií, které se ukáží jako pevně modré a mají silnou buněčnou stěnu, nazývají grampozitivní bakterie, označované jako Gram (+) , - na rozdíl od gramnegativních (tenké buněčná stěna), Gram (-) , která se při mytí zbarvila.

Po opláchnutí rozpouštědlem přidává Gramovo barvivo kontrastní červené barvivo, které barví všechny gramnegativní bakterie do červena nebo růžova. To je způsobeno přítomností vnější membrány, která brání pronikání barviva do buňky. Test klasifikuje bakterie do dvou skupin na základě struktury jejich buněčné stěny.

Použití v diagnostice

Gramovo barvení má velký význam v taxonomii bakterií, stejně jako pro mikrobiologickou diagnostiku infekčních onemocnění.

Grampozitivní kokální (kromě zástupců rodu Neisseria ) a sporonosné ( s výjimkou Coxiella burnetii ) formy bakterií, barví modročernou (tmavě modrou ) barvu .

Mnoho bakterií, které nenesou spóry, je gramnegativních a barví se červeně nebo růžově.

Technika barvení

Gramovo barvení označuje komplexní metodu barvení, kdy je nátěr vystaven dvěma barvivům, z nichž jedno je hlavní a druhé je doplňkové. Kromě barviv se pro složité způsoby barvení používají bělidla: alkohol, kyseliny atd.

Pro Gramovo barvení se častěji používají anilinová barviva trifenylmethanové skupiny: gencián, methyl violeť nebo krystalová violeť . Grampozitivní mikroorganismy poskytují silné spojení s uvedenými barvivy a jódem. Zároveň se při působení alkoholu nezbarvují, v důsledku čehož při dodatečném barvení fuchsinem grampozitivní mikroorganismy nemění původně přijatou fialovou barvu.

Gramnegativní mikroorganismy tvoří sloučeninu snadno zničitelnou alkoholem se zásaditými barvivy a jódem . V důsledku toho se mikrobi odbarví a poté se zbarví purpurovou a zčervenají.

Příprava materiálu pro malování

  1. Testovaný materiál se nanese v tenké vrstvě na povrch dobře odtučněného podložního sklíčka.
  2. Připravený nátěr se suší na vzduchu a po úplném zaschnutí se fixuje.
  3. Histologické řezy se připraví standardním způsobem, fixují se kousky tkáně ve formalínu a nalijí se do parafínu.

Oprava

Při fixaci je nátěr fixován na povrchu sklíčka, a proto při následném barvení preparátu nedochází k smývání mikrobiálních buněk. Usmrcené mikrobiální buňky se navíc barví lépe než živé.

Rozlišuje se fyzikální způsob fixace, který je založen na působení vysoké teploty na mikrobiální buňku, a chemické způsoby, při kterých se používají chemické látky způsobující koagulaci cytoplazmatických proteinů.

Fyzický způsob upevnění

Podložní sklíčko s preparátem se odebírá pinzetou nebo I a II prsty pravé ruky za žebra tahem nahoru a plynulým pohybem 2-3x přes horní část plamene hořáku. Celý proces fixace by neměl trvat déle než 2 s.

Spolehlivost fixace se kontroluje následujícím způsobem: povrch sklíčka zbavený roztěru se přiloží na zadní plochu levé ruky. Při správné fixaci nátěru by mělo být sklo horké, ale nemělo by způsobit pocit pálení (70-80 ° C).

Chemická metoda fixace

K fixaci nátěrů metylalkohol , aceton , Nikiforovova směs (směs ethylalkoholu 96% a anestetického esteru v poměru 1:1), Carnoyova kapalina (96% etylalkohol - 60%, chloroform  - 30%, ledová octová kyselina  - 10%) ), alkohol-formol (40% formalín  - 5 ml, 96% ethylalkohol - 95 ml). Sklíčko se zaschlým nátěrem se ponoří na 10-15 minut do lahvičky s fixačním prostředkem a poté se suší na vzduchu. Používá se také fixace v párech 40% formalínu na několik sekund.

Proces barvení šmouh

  1. Jedno z hlavních barviv se nalije na fixovaný nátěr po dobu 2-3 minut. Aby se zabránilo srážení, obarvte filtrační papír.
  2. Barvu slijte, opatrně odstraňte filtrační papír. Nátěr se naplní Lugolovým roztokem nebo Gramovým roztokem jodidu (vodný roztok jodidu draselného a krystalického jódu v poměru 2:1) po dobu 1-2 minut, dokud přípravek nezčerná.
  3. Roztok se scedí, nátěr se propláchne 96° ethylalkoholem nebo acetonem , nalévá a scedí, dokud nátěr nezmění barvu a vytékající kapalinu není čirá (přibližně 20-40-60 sekund).
  4. Sklíčka se důkladně omývají tekoucí nebo destilovanou vodou po dobu 1-2 minut.
  5. Pro identifikaci gramnegativní skupiny bakterií se preparáty navíc barví fuchsinem nebo safraninem (2–5 min.).
  6. Opláchněte pod tekoucí vodou a osušte filtračním papírem.

Gram- Weigertova technika barvení pro bakterie v histologických řezech

  1. Deparafinizované řezy se přivedou do vody.
  2. Barví se 20 minut v 1% roztoku pararosanilinu nebo zásaditého fuchsinu v 1% kyselině octové (roztok barviva se zahřeje k varu, ochladí a zfiltruje).
  3. Praný ve 3 výměnách destilované vody.
  4. Barvete 5 min v 1% krystalové violeti v destilované vodě.
  5. Rychle opláchněte v 1% roztoku chloridu sodného.
  6. Ošetřeno po dobu 30 s ve směsi: 1 díl jódu + 2 díly jodidu draselného + 100 dílů destilované vody.
  7. Navlhčete filtračním papírem.
  8. Odlišení nanesením směsi stejných objemů anilinu a xylenu (1-2 ml) na řez; roztoky se vypouštějí, dokud se oblaka barviva nepřestanou vzdalovat od řezu.
  9. Proveďte 3 výměny xylenu.
  10. Uzavřené v balzámu nebo jakékoli pryskyřici rozpuštěné v xylenu.

Výsledek: Grampozitivní bakterie jsou modročerné, fibrin fialový, jádra červená.

Viz také

Literatura

V němčině
  • Gram, HCÜber die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten  (německy)  // Fortschritte der Medizin: časopis. - 1884. - Bd. 2 . - S. 185-189 .
V angličtině
  • Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter HA Sneath. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology  (anglicky) . — 9. vyd. — Lippincott Williams & Wilkins, 1994.
  • Madigan, M.T.; Martinko J; Parker J. Brock Biologie mikroorganismů  (neurčité) . — 10. vydání. Lippincott Williams & Wilkins, 2004.
  • Ryan, KJ; Ray, C.G. Sherris Medical Microbiology  (neurčité) . - 4. vydání - McGraw Hill., 2004.
  • Aplikace barviv v klinické mikrobiologii // Biotechnic & Histochemistry, Volume 76, Number 3, May 01, 2001, pp. 119-125(7)
  Přejděte na položku Wikidata  Slovníky a encyklopedie