Imunochromatografická analýza

Aktuální verze stránky ještě nebyla zkontrolována zkušenými přispěvateli a může se výrazně lišit od verze recenzované 22. ledna 2017; kontroly vyžadují 16 úprav .

Imunochromatografická analýza (IHA)  ( angl.  Lateral flow test ) je imunochemická metoda analýzy založená na principu chromatografie na tenké vrstvě a zahrnující reakci mezi antigenem a jeho odpovídající protilátkou v biologických materiálech. Provádí se pomocí speciálních testovacích proužků, panelů nebo testovacích kazet.

Esence metody

Princip činnosti spočívá v tom, že když je testovací proužek ponořen do biologické tekutiny (nebo jiného kapalného vzorku), začne migrovat podél proužku podle principu chromatografie na tenké vrstvě. Spolu s ním se pohybují značené specifické protilátky nanesené na spodní část testovacího proužku, které se afinitně vážou na analyt.

Existují 2 formy ICA: přímá a konkurenční metoda.

  1. Přímé (sendvičové) schéma ICA používá konjugát protilátka-značka aplikovaný na membránu konjugátu. Na testovací linii byly imobilizovány protilátky specifické pro tento analyt a na kontrolní linii byly imobilizovány protidruhové protilátky specifické pro primární protilátky. Když je aplikován vzorek obsahující analyt, když vzorek narazí na membránu s konjugátem, analyt se naváže na konjugát At-tag. Poté imunitní komplex vstoupí do testovací zóny, kde se naváže na specifické protilátky a vytvoří „sendvič“ značky Ab-Ag-Ab. Přebytek nenavázaného konjugátu se váže na protidruhové protilátky v kontrolní linii. Detekce 2 čar na testovacím proužku je tedy pozitivním výsledkem testu. V nepřítomnosti analytu ve vzorku se konjugát váže na protidruhové protilátky pouze na kontrolní linii a na testovacím proužku tvoří jednu linii. Přímá metoda ICA se používá k detekci makromolekulárních sloučenin - virů včetně HIV; různé hormony (například v těhotenských testech), patogeny infekčních onemocnění.
  2. Kompetitivní metoda ICA používaná pro stanovení sloučenin s nízkou molekulovou hmotností je založena na kompetici mezi analytem a imobilizovaným konjugátem analyt:nosný protein o omezený počet specifických vazebných míst pro protilátku obsažených v konjugátu At-tag. Když je aplikován vzorek obsahující analyt, váže se na konjugát At-tag na membráně s konjugátem. Dále imunokomplex prochází testovací zónou, kde je imobilizován konjugát analyt:nosný protein. Imunokomplex se nemůže vázat na tento konjugát v důsledku sterické zábrany: sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností mají obvykle jednu antigenní determinantu, a proto protilátky mají jedno vazebné místo pro antigen, který je již obsazeným analytem. Dále je imunitní komplex vázán protidruhovými protilátkami, které jsou na kontrolní linii. V důsledku toho nepřítomnost barevného pruhu v testovací zóně a přítomnost barvy v kontrolní zóně ukazuje, že koncentrace analytu v testovaném vzorku překračuje svou prahovou hodnotu pro tento test.

V nepřítomnosti analytu ve vzorku se konjugát At-tag váže na konjugát Ag:nosič protein imobilizovaný v zóně testovací linie. Nenavázaný konjugát At-tag vstupuje do zóny kontrolní linie a váže se tam s protidruhovými protilátkami. Přítomnost dvou barevných čar (test a kontrola) je tedy negativním výsledkem analýzy.

Forma kompetitivní ICA se používá k detekci sloučenin s nízkou molekulovou hmotností, včetně metabolitů narkotických sloučenin v moči, ústní tekutině a tkáňových extraktech.

Výhodou metody je její rychlost a jednoduchost použití, možnost použití nepřístrojových ICA forem s vizuálním posouzením výsledku analýzy. V tomto případě není potřeba žádné vybavení a analýzu může provést nespecialista v jakýchkoli podmínkách, včetně „terénu“.

Existují také instrumentální semikvantitativní a kvantitativní formy ICA, které pomocí speciálních čteček zaznamenávají intenzitu štítku v testovací zóně testovacího proužku.

Štítky používané v IHA

V ICA se jako značky používají různé částice, které mají následující vlastnosti:

  1. Barviva (nanočástice koloidního zlata nebo uhlíku nebo částice barevného latexu). V tomto případě se využívá vizuální detekce výsledku, případně přístrojové kolorimetrické stanovení (nebo skenování). Použití různých barevných štítků připojených k latexovým částicím umožňuje multianalýzu, ve které různé barevné čáry odpovídají různým analytům. Nejčastěji používaným označením jsou nanočástice koloidního zlata.
  2. Fluorescenční, fosforescenční a bioluminiscenční značky kovalentně vázané na latexové částice. Tyto štítky se používají pouze v instrumentálních verzích ICA, kdy je výsledek zaznamenáván speciální čtečkou (senzorem). Mezi výše uvedenými jsou nejběžnější fluorescenční značky.
  3. Paramagnetické štítky (také připevněné k latexovým částicím). Tento typ značek se používá v ICA s použitím zařízení, která zaznamenávají sílu magnetického pole.
  4. Enzymové značky se používají stejným způsobem jako v ELISA. Enzymatická reakce se zaznamenává barvením substrátů a výsledek analýzy je vizuální nebo odečtený senzorem.
  5. Novým směrem ve vývoji různých typů ICA je použití liposomů jako nosičů různých druhů značek (barvicí, fluorescenční, enzymatické, elektroaktivní atd.).

Literatura

Odkazy