Knockout myš

Knokautovaná myš  je geneticky modifikovaná laboratorní myš, u které je jeden z genů cíleně vyřazen delecí nebo nahrazením určitou nukleotidovou sekvencí . S jejich pomocí je snadné studovat role sekvenovaných genů, jejichž funkce dosud nebyly určeny. Narušením konkrétního genu a zkoumáním výsledných rozdílů od normálního chování nebo fyziologie se experimentátoři mohou pokusit určit jeho funkci.

Fyziologie člověka je podobná jako u myší a vědci mohou tato zvířata používat k testování lékařských technologií souvisejících s fyziologií člověka, protože použití lidských embryí není vědeckou komunitou přijímáno z etických důvodů. Myši jsou proto v současnosti nejvhodnějším druhem laboratorních zvířat, u kterých lze knockout metodu snadno aplikovat. První knockout myš vytvořili Mario R. Capecchi , Martin Evans a Oliver Smithies v roce 1989, za což jim byla v roce 2007 udělena Nobelova cena za fyziologii a medicínu . Aspekty technologie knockout myší a myší samotné byly patentovány v mnoha zemích soukromými společnostmi. Knokaut genu u laboratorních krys je mnohem obtížnější a je možný až od roku 2003 [1] [2] .

Použití

Vypnutí aktivity genu poskytuje cenná vodítka k tomu, jak funguje. Vzhledem k podobnosti mezi lidskými a myšími geny poskytuje pozorování charakteristik knockout myší data pro výzkumníky. Na základě těchto informací vědci vyvozují závěry o úloze genu ve vývoji organismu [3] , zejména o schopnosti reagovat na nemoci u lidí.

Příklady výzkumu, ve kterém byly knockout myši užitečné, zahrnují studium a modelování různých typů rakoviny, obezity, srdečních chorob, cukrovky, artritidy, zneužívání návykových látek, úzkosti, stárnutí a Parkinsonovy choroby . Knockout myši také nabízejí biologický kontext, ve kterém lze vyvíjet a testovat léky a další terapie.

Postup

„K získání knockout myší je výsledný geneticky upravený konstrukt zaveden do embryonálních kmenových buněk, kde konstrukt prochází somatickou rekombinací a nahrazuje normální gen, a implantace modifikovaných buněk do šlechtění nových odrůd klasickou selekcí je téměř nemožná, proto , v současnosti jsou hlavní naděje vkládány do genetického inženýrství. Knokaut genu lze použít ke studiu funkce konkrétního genu. Tak se nazývá technika delece jednoho nebo více genů, která umožňuje studovat důsledky takové mutace. Pro knockout je syntetizován stejný gen nebo blastocysta jeho náhradní matky“ [4] .

Schéma chovu pro získání knockout myší. Tvorba myší začíná v okamžiku vytvoření buněčných kultur, jejichž zavedením je vytvořen požadovaný organismus do mladého embrya. Pomocí lambda fága nebo kosmidu je cílový gen extrahován z myší genomové knihovny in vivo metodou. Místo toho je vložen dominantní selektovatelný marker, zatímco cílový gen je ve stejnou dobu odstraněn . "V důsledku toho se získá (molekulární biologie) | hybridní plazmid , ve kterém jsou segmenty cílového myšího genu (lemující sekvence) připojeny k selekčnímu markeru vpravo a vlevo. Buňky s inaktivovaným genem jsou vloženy do blastocytů. Embryonální kmenové buňky jsou izolovány z myší blastocysty (velmi mladé embryo) a kultivovány in vitro. Pro tento příklad použijeme kmenové buňky bílé myši. Blastocysty obsahující buňky, které jsou jak divoké, tak knockoutované buňky, jsou injikovány do dělohy adoptivní matky Výsledkem jsou potomci nebo divoký typ, obarveni stejnou barvou jako dárce blastocysty (šedá) nebo chiméra (smíšené) a částečně vyřazené chimérické myši jsou zkříženy s normální myší divokého typu (šedá) a produkují potomky, kteří jsou buď bílé a heterozygotní pro knock-out gen, nebo šedé a divokého typu Bílé heterozygotní myši mohou být následně vyšlechtěny, aby produkovaly myši homozygotní pro genový knockout.

Existuje několik variant v postupu pro získání knockout myší; níže je typický příklad.

Nová sekvence z kroku 1 je zavedena do kmenových buněk z kroku 2 elektroporací. V důsledku přirozeného procesu homologní rekombinace některé z elektroporovaných kmenových buněk začlení novou sekvenci knockout genu do svých chromozomů místo původního genu. Šance na úspěšnou rekombinaci jsou relativně nízké, takže většina změněných buněk bude mít novou sekvenci pouze na jednom ze dvou odpovídajících chromozomů – jsou považovány za heterozygotní. Buňky, které byly transformovány vektorem obsahujícím gen rezistence na neomycin a gen herpes tk+, se pěstují v roztoku obsahujícím neomycin a ganciklovir, aby se vybraly transformace, ke kterým došlo prostřednictvím homologní rekombinace. Jakákoli inzerce DNA, ke které dojde v důsledku náhodného vložení, zemře, protože jsou pozitivní jak na gen rezistence na neomycin, tak na produkt genu herpes tk+, jehož genový produkt reaguje s ganciklovirem za vzniku smrtícího toxinu. Navíc buňky, které neintegrují žádný z genetických materiálů, testují oba geny negativně, a proto umírají v důsledku otravy neomycinem.

Embryonální kmenové buňky, které zahrnovaly knockout gen, jsou izolovány z nezměněných buněk pomocí markerového genu z kroku 1. Nezměněné buňky mohou být například zabity toxickým činidlem, vůči kterému jsou změněné buňky rezistentní. Knockoutové embryonální kmenové buňky z kroku 4 jsou injikovány do myší blastocysty. Pro tento příklad používáme blastocysty šedé myši. Blastocysty nyní obsahují dva typy kmenových buněk: původní (z šedé myši) a knockout buňky (z bílé myši). Tyto blastocysty se pak implantují do dělohy myších samic, kde se vyvinou. Novorozené myši tedy budou chiméry: některé části jejich těl jsou tvořeny z původních kmenových buněk, jiné z vyřazených kmenových buněk. Jejich srst bude vykazovat bílé a šedé skvrny, s bílými skvrnami pocházejícími z vyřazených kmenových buněk a šedými skvrnami z přijímající blastocysty. Některé novorozené chimérické myši budou mít gonády odvozené z vyřazených kmenových buněk, a proto budou produkovat vajíčka nebo spermie obsahující vyřazený gen. Když jsou tyto chimérické myši zkříženy s jinými myšmi divokého typu, někteří z jejich potomků budou mít jednu kopii knockout genu ve všech svých buňkách. Tyto myši si neuchovávají žádnou DNA šedé myši a nejsou chiméry, nicméně jsou stále heterozygotní. Když se tito heterozygotní potomci kříží, někteří z jejich potomků zdědí knockout gen od obou rodičů; nenesou funkční kopii původního nezměněného genu (to znamená, že jsou pro danou alelu homozygotní). Podrobné vysvětlení toho, jak vznikají myši knockout (KO), je na webových stránkách Nobelovy ceny za fyziologii a medicínu z roku 2007 [5] .

Omezení

National Institutes of Health diskutuje o některých důležitých omezeních této techniky [6] .

Stejně jako všechny laboratorní myši nemají knockout myši dobrou imunitu vůči přirozeným chorobám. To je ale kompenzováno jejich vysokou citlivostí na konkrétní patogen, pro který jsou vytvořeny.

Zatímco technologie knockout myši je cenným výzkumným nástrojem, existují některá důležitá omezení. Asi 15 procent genových knockoutů je vývojově smrtelných, což znamená, že z geneticky modifikovaných embryí nemohou vyrůst dospělé myši. Tento problém je často překonán podmíněnými mutacemi. Nedostatek dospělých myší omezuje výzkum na embryonální vývoj a často ztěžuje určení funkce genu ve vztahu k lidskému zdraví. V některých případech může gen u dospělých vykonávat jinou funkci než u vyvíjejících se embryí.

Vyřazení genu také nemusí mít za následek znatelné změny u myši, nebo může dokonce vést k charakteristikám odlišným od charakteristik pozorovaných u lidí, kteří mají stejný gen inaktivovaný. Například mutace v genu p53 jsou spojeny s více než polovinou lidských rakovin a často vedou k nádorům ve specifické sadě tkání. Když je však gen p53 u myší vyřazen, u zvířat se vyvinou nádory v jiném tkáňovém poli.

V průběhu postupu existuje variabilita, která do značné míry závisí na kmeni, ze kterého byly kmenové buňky získány. Typicky se používají buňky odvozené z kmene 129. Tento specifický kmen není vhodný pro mnoho experimentů (např. behaviorálních), takže je velmi běžné zpětné křížení potomstva s jinými kmeny. Některé genomové lokusy se ukázaly být velmi obtížně identifikovatelné. Důvodem může být přítomnost repetitivních sekvencí, rozsáhlá metylace DNA nebo heterochromatin. Matoucí přítomnost sousedních 129 genů v knockout segmentu genetického materiálu byla nazvána „efektem lemujícího genu“. [7] Pro řešení tohoto problému byly navrženy metody a pokyny [7] .

Dalším omezením je, že normální (tj. nepodmíněné) knockout myši se vyvíjejí v nepřítomnosti studovaného genu. Někdy může ztráta aktivity během vývoje maskovat roli genu v dospělosti, zvláště pokud je gen zapojen do více procesů, které překlenují vývoj. Poté jsou vyžadovány přístupy podmíněné/indukovatelné mutace, které nejprve umožní myši normálně se vyvíjet a dospívat, dokud není odstraněn požadovaný gen.

Dalším velkým omezením je nedostatek evolučních adaptací v knockout modelu, ke kterému může dojít u zvířat divokého typu po jejich přirozené mutaci. Například koexprese GLUT1 se stomatinem specifická pro erytrocyty je kompenzačním mechanismem u savců, kteří nejsou schopni syntetizovat vitamín C [8] .

Poznámky

  1. ↑ Helen R. Pilcherová. Je to knockout   // Příroda . - 2003. - doi : 10.1038/news030512-17 .
  2. ↑ Zan Y, Haag JD, Chen KS, Shepel LA, Wigington D, Wang YR, Hu R, Lopez-Guajardo CC, Brose HL, Porter KI, Leonard RA, Hitt AA, Schommer SL, Elegbede AF, Gould MN. Produkce knockoutovaných krys pomocí mutageneze ENU a screeningového testu na bázi kvasinek  //  Nature Biotechnology. - 2003. - Sv. 21 , iss. 6 . — S. 645–51 . - doi : 10.1038/nbt830 . — PMID 12754522 .
  3. ↑ Shchelkunov S. N. Genetické inženýrství . - Nakladatelství Sibiřské univerzity, 2004. - S. 453.
  4. ↑ Rizvanová A. Kh. Bioetické principy a genetické inženýrství . - 2013. - S. 2.
  5. ↑ Nobelova cena za  medicínu za rok 2007 . nobelprize.org . Získáno 21. ledna 2022. Archivováno z originálu dne 25. června 2018.
  6. ↑ Přehled Knockout Mice Archived 16. prosince 2018 na Wayback Machine / National Human Genome Research Institute
  7. ↑ 1 2 Robert Gerlai. Studie chování savců zaměřené na geny: je to mutace nebo genotyp pozadí?  (anglicky)  // Trends in Neurosciences. - 1996. - Květen (roč. 19). - S. 177-181 . — ISSN 0166-2236 . - doi : 10.1016/S0166-2236(96)20020-7 .
  8. ↑ Crusio WE, Goldowitz D., Holmes A., Wolfer D. Standardy pro publikaci studií myších mutantů  //  Genes, Brain and Behavior. - 2009. - 28. ledna (vol. 8). - str. 1-4 . — ISSN 1601-1848 . - doi : 10.1111/j.1601-183X.2008.00438.x .
  Přejděte na položku Wikidata  Slovníky a encyklopedie