Dvoufotonový laserový mikroskop - laserový mikroskop , který umožňuje pozorovat živé tkáně v hloubce více než jeden milimetr pomocí fenoménu fluorescence . Dvoufotonový mikroskop je druh vícefotonového fluorescenčního mikroskopu . Jeho předností oproti konfokálnímu mikroskopu je jeho vysoká penetrační síla a nízká fototoxicita [1] .
Dvoufotonový mikroskop poprvé zkonstruoval Winfred Denk v laboratoři W. W. Webba na Cornell University [2] . Spojil myšlenku dvoufotonového buzení s laserovým skenováním.
Dvoufotonový laserový mikroskop je založen na fyzikálním principu, který popsala Maria Goeppert-Mayer ve své doktorské práci [3] v roce 1931.
Proces dvoufotonové excitace probíhá následovně: dva nízkoenergetické fotony excitují fluorofor (molekula nebo část molekuly schopná fluorescence) během jedné kvantové události. Výsledkem této excitace je následná emise fluorescenčního fotonu excitovanými molekulami. Energie fluorescenčního fotonu je větší než energie excitujících fotonů.
Pravděpodobnost, že oba fotony excitace budou absorbovány jednou molekulou, je velmi malá. Proto je vyžadován velký tok excitačních fotonů, které lze získat pomocí laseru emitujícího fotony s vysokou frekvencí opakování pulsů (80 MHz). Nejčastěji používané fluorofory mají excitační spektrum v rozsahu 400-500 nm, přičemž vlnová délka excitačního laseru je v rozsahu 700-1000 nm (infračervená oblast). Pokud fluorofor absorbuje dva fotony současně, pak obdrží dostatek energie, aby přešel do excitovaného stavu. Dále bude excitovaný fluorofor emitovat jeden foton (ve viditelné části spektra), jehož vlnová délka závisí na typu fluoroforu.
Protože pro vstup fluoroforu do excitovaného stavu je nezbytná absorpce dvou fotonů, je pravděpodobnost, že fluorofor emituje sekundární foton, úměrná druhé mocnině intenzity excitace. Proto bude fluorescence silnější, když je laserový paprsek jasně zaostřený a není rozptýlený. Maximální fluorescence je pozorována v ohniskovém objemu (objem, na který je laserový paprsek zaostřen) a vykazuje prudký pokles v neostré oblasti.
Ve dvoufotonovém mikroskopu je infračervený laserový paprsek zaostřen pomocí čočky sbíhajícího se objektivu . Typicky se používá vysokofrekvenční 80 MHz safírový laser, který vysílá 100 femtosekundový pulz poskytující vysokou hustotu fotonového toku potřebnou pro dvoufotonovou absorpci.
Světlo emitované z fluorescenčního vzorku je zesíleno pomocí vysoce citlivé trubice fotonásobiče . Protože přijímač světla je jednokanálový, intenzita světla pozorovaná v daném ohniskovém objemu tvoří jeden obrazový pixel . Aby se získal dvourozměrný pixelový obraz, skenování se provádí v ohniskové rovině vzorku.
Použití infračerveného světla k excitaci fluoroforu ve studovaných tkáních má své výhody [4] :
Ale existují i některé nevýhody: