Fluorescenční mikroskopie je metoda pro získání zvětšeného obrazu pomocí luminiscence excitovaných atomů a molekul vzorku. Široce používán v materiálových vědách a biomedicínských oborech.
Molekuly jsou schopny absorbovat světelná kvanta a přecházet do elektronicky excitovaných stavů. Návrat molekuly do „normálního“ (základního) stavu, doprovázený emisí světla, se nazývá fluorescence . Absorpce a fluorescence jsou určeny strukturou energetických hladin elektronů molekuly, a proto je specifickou vlastností pro každý typ molekuly (viz podrobnosti v článku Elektronově- vibrační spektroskopie ).
Biologický materiál zpravidla sám o sobě fluoreskuje velmi slabě, ale díky použití jasných a různorodých fluorescenčních molekul ( fluoroforů ), které mohou specificky barvit různé struktury tkání a buněk, se metoda fluorescenční mikroskopie ukázala jako velmi cenná pro biomedicínské vědy.
Tradiční metody fluorescenční mikroskopie mají výrazně nižší rozlišení ve srovnání s elektronovou nebo atomární mikroskopií . Na rozdíl od posledně jmenovaného však optická mikroskopie umožňuje pozorovat vnitřní mikrostrukturu buněk a dokonce i malých organismů, a to nejen pevných, ale i živých. Díky tomu se fluorescenční mikroskopie ukázala jako nejlepší metoda pro studium mechanismů fungování organismů na buněčné, subcelulární a molekulární úrovni.
Ve fluorescenčním mikroskopu je vzorek ozářen světlem o vyšší frekvenci a obraz je získán v optickém spektru. Záření vzorku prochází filtrem, který omezuje světlo na excitační frekvenci. Obraz fluorescenčního preparátu lze vyfotografovat specializovaným digitálním fotoaparátem, který umožňuje fotografování s dlouhou expozicí. U některých snímků může tato doba činit až 60 minut.
Intenzivní rozvoj fluorescenční mikroskopie na přelomu 20. a 21. století vedl k rozvoji nových metod - dvoufotonové a konfokální mikroskopie a řady přístupů, které umožnily překonat difrakční bariéru optického rozlišení a dosáhnout bezprecedentního nanorozlišení.
Jedním z typů fluorescenční mikroskopie je konfokální mikroskopie , metoda, která umožňuje získat obraz dané vrstvy vzorku a zbavit se příspěvku vrstev nad a pod. Tato metoda má tedy srovnatelné rozlišení podél tří souřadnicových os. Jiný typ fluorescenční mikroskopie, epifluorescenční mikroskopie, umožňuje zkoumat povrch a úzkou blízkopovrchovou zónu vzorku.
Totální vnitřní reflexní fluorescenční mikroskopie (TIRFM) je založena na jevu odrazu elektromagnetických vln od rozhraní mezi dvěma průhlednými médii, ke kterému dochází, když vlna dopadá z média s vyšším indexem lomu pod úhlem větším, než je kritický úhel (1 /n). Intenzita záření pronikajícího do druhého prostředí se rozpadá podle exponenciálního zákona, což umožňuje detekovat fluorescenční objekty excitované tímto zářením v ~100 nm tlusté mezní vrstvě s rozlišením až 10 nm [1] . TIRFM lze tedy právem považovat za jednu z metod fluorescenční nanoskopie. V biologii se metoda používá k zobrazení plazmatické membrány a membránových struktur buněk.
V posledních letech bylo vyvinuto několik nových přístupů v oblasti fluorescenční mikroskopie, které umožnily překonat difrakční bariéru optického rozlišení a dosáhnout velmi vysokých ~10 nm. Tyto metody se začaly spojovat pod obecný pojem fluorescenční nanoskopie.