Kapilární elektroforéza

Kapilární elektroforéza , známá také jako kapilární zonální elektroforéza ( CZE ), se používá k oddělení iontů nábojem . V případě konvenční elektroforézy se nabité molekuly pohybují ve vodivé kapalině pod vlivem elektrického pole . V 60. letech 20. století byla navržena technika kapilární elektroforézy k oddělení molekul podle náboje a velikosti v tenké kapiláře naplněné elektrolytem .

Vybavení

Kapilární elektroforéza vyžaduje relativně jednoduché vybavení. Schéma experimentu je znázorněno na Obr . Hlavními součástmi systému jsou aplikační lahvička, startovací lahvička, finální lahvička, kapilára, elektrody, vysokonapěťový zdroj, detektor a zařízení pro zpracování dat. Láhev pro aplikaci vzorku, počáteční láhev a koncová láhev jsou naplněny elektrolytem, jako je vodný roztok pufru. Pro aplikaci vzorku se konec kapiláry ponoří do lahvičky na vzorek a poté se přenese do lahvičky se startérem. Pohyb analyzovaných látek probíhá působením elektrického pole. Všechny ionty se pod vlivem elektroosmotického proudu pohybují podél kapiláry jedním směrem. Analyty jsou separovány elektroforetickou pohyblivostí a jsou detekovány blízko konce kapiláry. [jeden]

Detekce

Detekce separovaných molekul během kapilární elektroforézy může být prováděna různými zařízeními. Nejběžnější přístroje detekují změny v absorpci záření v ultrafialové oblasti nebo v oblasti viditelného světla. Typicky se v takových systémech jako článek používá část kapiláry. Délka dráhy procházejícího světla při kapilární elektroforéze je řádově 50 mikrometrů, což je mnohem méně než v případě běžných ultrafialových článků, u kterých je délka dráhy světla řádově 1 centimetr.

Podle Bouguer-Lambert-Beerova zákona je citlivost detektoru úměrná délce dráhy, kterou světlo prochází buňkou. Pro zvýšení citlivosti se prodlužuje dráha, po které se světlo šíří, ale s rostoucí velikostí buňky se rozlišení snižuje. Kapilární trubice může být rozšířena v místě detekce, tento druh se nazývá bublinová buňka. V další možnosti je zvýšení dráhy procházejícího světla dosaženo přidáním další kapiláry (viz obrázek 2 ). Obě tyto metody snižují účinnost separace. [2]

Fluorescenční detekci lze použít při kapilární elektroforéze přirozeně fluorescenčních vzorků nebo chemických modifikací, které zavádějí fluorescenční značky. Tato detekční metoda poskytuje vysokou citlivost, ale nelze ji použít k detekci nefluorescenčních vzorků. Používá se také laserem indukovaná fluorescenční detekce, takové systémy kapilární elektroforézy mohou detekovat v rozsahu 10 −18 - 10 −21 mol.

K rozlišení podobných vzorků lze kapilární elektroforézní separační systémy přímo připojit k hmotnostním spektrometrům. Ve většině takových systémů je konec kapiláry umístěn v elektroaerosolovém ionizačním zařízení . Ionizované částice jsou dále analyzovány hmotnostní spektrometrií. [2]

Separační metody

Molekuly jsou odděleny kapilární elektroforézou kvůli rozdílům v pohyblivosti v aplikovaném elektrickém poli. Rychlost pohybu ( ) separovaných molekul v aplikovaném poli vzhledem k elektrodě s opačným nábojem: $u_{p}$

$u_{p}=\mu _{p}E$

kde je elektroforetická pohyblivost a E je síla elektrického pole. Elektroforetická pohyblivost je úměrná náboji iontu. V případě, že se vzorek skládá ze dvou typů molekul, které se liší nábojem, dochází k separaci v důsledku elektroforézy. Elektroforetická pohyblivost látky při daných hodnotách pH je: $\mu _{p}$

$\mu _{p}={\frac {z}{6\pi \eta r}}$

kde je specifický náboj molekuly a je Stokesův poloměr molekuly: ${\displaystyle {z))$ $r$

$r={\frac {k_{B}T}{6\pi \eta \ D}}$

kde je Boltzmannova konstanta a teplota a D je koeficient difúze . Tyto rovnice ukazují, že elektroforetická pohyblivost molekuly je úměrná náboji a nepřímo úměrná jejímu poloměru. Elektroforetickou pohyblivost lze experimentálně určit z doby pohybu molekuly v elektrickém poli dané síly: $k_B$ $T$

$\mu _{p}=\left({\frac {L}{t_{r}}}\right)\left({\frac {L_{t}}{V}}\right)$

kde je vzdálenost od výchozího bodu k místu detekce, je čas, který analyzovaná molekula potřebuje k dosažení bodu detekce, je intenzita elektrického pole a je celková délka kapiláry. [2] Jelikož elektrické pole působí pouze na nabité molekuly, jsou nenabité molekuly slabě odděleny kapilární elektroforézou. $L$ $t_{r}$ $PROTI$ ${\displaystyle L_{t))$

Rychlost pohybu analyzovaných molekul při kapilární elektroforéze závisí na velikosti elektroosmotického toku v pufru. Obecně je elektroosmotický tok směrován k záporně nabité katodě. Molekuly se liší v elektroforetické pohyblivosti a pohybují se směrem k opačně nabité elektrodě. [1] Záporně nabité částice se pohybují směrem ke kladně nabité anodě, kladně nabité částice se pohybují směrem ke katodě ve směru elektroosmotického toku (viz obrázek 3 ).

Elektroosmotický průtok může být reprezentován jako: $u_{o}$

$u_{o}=\mu _{o}E$

kde se elektroosmotická pohyblivost rovná: $\mu _{o}$

$\mu _{o}={\frac {\epsilon \zeta }{\eta }}$

kde je potenciál kapilární stěny a je relativní permitivita roztoku pufru. Elektroosmotická pohyblivost může být určena měřením doby zpoždění neutrálně nabitých molekul. [2] Rychlost pohybu ( ) analyzované molekuly v elektrickém poli lze vyjádřit jako: $\zeta$ $\epsilon$ $u$

$u_{p}+u_{o}=(\mu _{p}+\mu _{o})E$

Vzhledem k tomu, že elektroosmotický tok tlumivého roztoku je obvykle větší než elektroforetický tok analyzovaných látek, všechny analyzované molekuly se pohybují s tlumivým roztokem ke katodě. Záporně nabité molekuly zůstávají déle v kapiláře kvůli rozporům v jejich elektroforetické pohyblivosti. [1] Pořadí pohybu nabitých molekul je znázorněno na obrázku 3 : malé kationty se pohybují rychle, malé vícenásobně nabité anionty jsou silně zpožděny. [2]

Efektivita a rozlišení

Počet teoretických pater neboli účinnost separace v případě kapilární elektroforézy je dána rovnicí:

${\displaystyle N={\frac {\mu V}{2D_{m))))$

kde je počet teoretických pater, je zjevná pohyblivost v separačním médiu a je difúzní koeficient látky, která má být separována. Podle této rovnice je účinnost separace omezena pouze difúzí a je úměrná síle elektrického pole. Účinnost separace kapilární elektroforézou je obecně mnohem vyšší než u jiných separačních metod, jako je vysokoúčinná kapalinová chromatografie . Na rozdíl od HPLC nedochází v případě kapilární elektroforézy k žádnému přenosu hmoty mezi fázemi. [2] Průtokový profil v případě elektroosmotických průtokových systémů je plochý, na rozdíl od laminárního profilu chromatografických kolon, ve kterých k separaci dochází pod tlakem (viz obrázek 5 ). V důsledku toho během elektroosmotické separace nedochází k expanzi pásu, jako při chromatografii. Separace kapilární elektroforézou může mít několik set tisíc teoretických pater. [3] $N$ $\mu$ ${\displaystyle D_{m))$

Rozlišení ( ) separace kapilární elektroforézou lze zapsat jako: $R_{s}$

$R_{s}={\frac {1}{4))\left({\frac {\triangle \mu _{p}{\sqrt {N))}{\mu _{p}+\ mu _{o}}}\right)$

V souladu s touto rovnicí je maximálního rozlišení dosaženo při podobných hodnotách elektroforetické a elektroosmotické pohyblivosti, ale s opačným znaménkem. Navíc vysoké rozlišení vyžaduje nízkou rychlost, a proto vyžaduje delší dobu separace. [2]

Související metody

Separace kapilární elektroforézou je založena na rozdílech v elektroforetické pohyblivosti molekul, které mají být separovány. Některé třídy molekul však nelze oddělit, protože jsou nenabité nebo se mírně liší v elektroforetické pohyblivosti. K separaci neutrálních (nenabitých) složek vzorku se používá micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) , při které se do tlumivého roztoku přidávají povrchově aktivní látky za vzniku micel . Nabité polymery, jako je DNA, mohou být separovány v kapilárách naplněných gelem; gel zpomaluje delší molekuly více než kratší. Tato varianta kapilární elektroforézy se nazývá kapilární gelová elektroforéza. Některé systémy kapilární elektroforézy lze použít pro chromatografii v mikroměřítku. Také systémy kapilární elektroforézy lze použít pro izotachoforézu , izoelektrickou fokusaci a afinitní elektroforézu .

Poznámky

↑ 1 2 3 4 Skoog, D.A.; Holler, FJ; Crouch, S. R. "Principles of Instrumental Analysis" 6. vydání. Thomson Brooks/Cole Publishing: Belmont, CA 2007 .
↑ 1 2 3 4 5 6 7 Skoog, D.A.; Holler, FJ; Crouch, S. R. "Principles of Instrumental Analysis" 6. vydání. Kapitola 30 Thomson Brooks/Cole Publishing: Belmont, CA 2007 .
↑ Skoog, D.A.; Holler, FJ; Nieman, TA "Principy instrumentální analýzy, 5. vydání." Vydavatelství Saunders College: Philadelphia, 1998 .

Literatura

Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Tsuchiya, A.; Ando, T. Anal. Chem . 1984 , 56 , 111.
Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Tsuchiya, A.; Ando, T. Anal. Chem . 1984 , 56 , 113.
Foley, JP Anal. Chem . 1990 , 62 , 1302.
Carretero, AS; Cruces-Blanco, C.; Ramirez, S.C.; Pancorbo, AC; Gutierrez, A. F. J. Agric. jídlo. Chem . 2004 , 52 , 5791.
Cavazza, A.; Corradini, C.; Laura, A.; Nicoletti, I. J. Agric. potravinářská chemie 2000 , 48 , 3324.
Rodrigues, MRA; Caramao, EB; Arce, L.; Rios, A.; Valcarcel, M. J. Agric. potravinářská chemie 2002 , 50 , 4215.

Viz také

elektroforéza

Odkazy

Animace kapilární elektroforézy
Kapilární elektroforéza pro odborníky a začátečníky Archivováno 4. května 2015 na Wayback Machine