Kryoprotektory jsou látky , které chrání živé předměty před škodlivými účinky mrazu. Kryoprotektory se používají při kryokonzervaci - nízkoteplotním skladování živých předmětů (jinými slovy při zmrazování buněčných kultur , krve, spermií , embryí, izolovaných orgánů a celých biologických objektů).
Vitrifikace má důležité aplikace pro uchování embryí, biologických tkání a orgánů pro transplantaci. Vitrifikace se také používá v kryonice. k opravě poškození mrazem. Kryoprotektivní vlastnosti těchto látek spočívají ve snížení teploty skelného přechodu zmrazeného předmětu pod bod tání. Kryoprotektanty tedy zabraňují účinnému zmrazování a systém si zachovává určitou flexibilitu ve sklovité fázi, chová se tedy jako amorfní pevná látka, která tuhne bez tvorby krystalů, které mohou vzorek poškodit.
V případě biologických vzorků není poškození způsobeno především ledovými krystaly (protože vnitřek buněk tímto způsobem běžně nezamrzá, pokud vůbec), ale změnami osmotického tlaku a iontové síly (obsah elektrolytů v buňce tekutina). Při zmrazování jsou živé předměty ovlivněny dvěma škodlivými faktory: tvorbou intracelulárního ledu a dehydratací . Umístění živých předmětů do roztoků kryoprotektantů a zmrazování v těchto roztocích snižuje nebo zcela eliminuje tvorbu intracelulárního ledu a dehydrataci.
Mnoho kryoprotektantů také funguje tak, že vytváří vodíkové vazby s biologickými molekulami, když nahrazují molekuly vody. Vodíková vazba ve vodných roztocích je nezbytná pro správné fungování proteinů a DNA. Když tedy kryoprotektant nahradí molekuly vody, biologický materiál si zachová svou přirozenou fyziologickou strukturu (a funkci), ačkoli již není ponořen do vodního prostředí. Taková konzervační strategie je velmi často vidět u anhydrobiózy .
Existuje velké množství látek s kryoprotektivními vlastnostmi, ale v lékařské a laboratorní praxi se nepoužívá více než tucet sloučenin, které budou uvedeny níže. Existují dva typy kryoprotektiv: penetrační a nepenetrující.
Kryoprotektiva fungují tak, že zvyšují koncentraci rozpuštěných látek v buňkách. Aby však byly biokompatibilní, musí (1) snadno pronikat do buněk a (2) být netoxické pro samotné buňky. Po rozmrazení je nutné živé předměty zbavit kryoprotektorů.
Biologické nemrznoucí směsi zahrnují nízkomolekulární sloučeniny a nemrznoucí směsi. Nacházejí se zejména v organismech arktického klimatu. Jako nízkomolekulární sloučeniny se mimo jiné používají glycerol , další polyoly , močovina a glukóza . Jsou to sloučeniny, které snadno tvoří vodíkové vazby se sousedními molekulami vody. Sloučeniny pronikající do buněčných membrán zabraňují růstu ledových krystalků. To snižuje teplotu mrazu uvnitř buněk. V některých případech se také snižuje koncentrace vody v buňkách ( anhydrobióza ).
Většina nemrznoucích proteinů nezabrání zamrznutí buněčné plazmy, ale může je mírně oddálit. Jejich působení je založeno na tom, že inhibují růst ledových krystalků a chrání již vytvořené ledové krystaly, které mohou působit jako krystalizační jádra . Výsledkem je, že výsledné krystaly zůstávají malé, led se stává jemnozrnným a nemůže zničit buněčné struktury, i když zmrzne. Po rozmrazení buňka obnoví své normální funkce.
Nemrznoucí proteiny (AFP) patří do třídy polypeptidů produkovaných určitými obratlovci, rostlinami, houbami a bakteriemi, které jim umožňují přežít v negativním prostředí. Tyto proteiny se vážou na malé krystalky ledu a brání jejich růstu a rekrystalizaci, která by jinak byla smrtelná. Existuje také stále více důkazů, že AFP interagují s buněčnými membránami savčích buněk, aby je chránily před poškozením chladem.
Nemrznoucí proteiny nesnižují bod tuhnutí úměrně koncentraci. Spíše fungují nekoligativně [1] . To jim umožňuje působit jako nemrznoucí směs v koncentracích 1/300 až 1/500 ostatních rozpuštěných látek s následnou minimalizací jejich vlivu na osmotický tlak. Tyto neobvyklé schopnosti jsou připisovány jejich schopnosti vázat se na určité povrchy ledových krystalů.
Nemrznoucí proteiny vytvářejí rozdíl mezi bodem tání ledu a bodem tuhnutí vody, známý jako tepelná hystereze . Přídavek AFP proteinů na rozhraní mezi ledem a kapalnou vodou inhibuje termodynamicky příznivý růst ledových krystalků. Růst krystalů je kineticky inhibován AFP, který pokrývá povrchy ledových krystalů přístupných vodě.
Nejběžnějšími kryoprotektanty v průmyslu jsou různé glykoly, tedy polyhydroxoalkoholy ( ethylenglykol , propylenglykol , glycerol ). Ethylenglykol je složkou zimních kapalin do chladičů automobilů a propylenglykol se někdy používá ke snížení množství ledových krystalků ve zmrzlině a vytvoření hladší textury. Dalším oblíbeným kryoprotektantem je dimethylsulfoxid spolu s glycerolem, běžně používaným k ochraně biologických vzorků (spermie, embrya) při jejich skladování v kapalném dusíku.
Pro zvýšení účinnosti kryoprotektiv a zmírnění vedlejších účinků z jejich použití se nejčastěji používají jejich směsi. Směs formamidu s dimethylsulfoxidem, propylenglykolem a odpovídajícím koloidem je dlouhodobě nejúčinnějším uměle vytvořeným kryoprotektantem.
Vitrifikace je široce používána jako metoda kryokonzervace embryí a oocytů . Uvedeného skelného přechodu je dosaženo velmi rychlým ochlazením, při kterém se používá vysoce koncentrovaný roztok, který při zmrazování nekrystalizuje, takže jeho viskozita roste s klesající teplotou, dokud nevznikne amorfní pevná látka. Rychlost poklesu teploty dosahuje 23000°C/min. K dosažení velké změny teploty při vysoké rychlosti se používá minimální objem média (méně než 0,1 mikrolitru) a kapalný dusík při -196 ° C. Expoziční a mrazicí rychlost musí být dostatečně vysoká, aby se zabránilo toxicitě a tvorbě intracelulárních krystaly, které mohou poškodit buňky obsahu. Pro dosažení velmi rychlé dehydratace se používají kryoprotektory ve vysokých koncentracích. Rychlost zmrazování/rozmrazování je nepřímo úměrná koncentraci kryoprotektivních látek. Před zmrazením musí být biologický materiál ekvilibrován tímto kryoprotektivním roztokem (v nižší koncentraci), aby vydržel osmotický šok. Míra přežití vzorků přesahuje 90 % a embrya obvykle přežívají intaktní.
Jakmile je v laboratoři doladěna vitrifikace, míra přežití přesahuje 90 %, bez ohledu na typ vzorku. Embrya obvykle přežívají neporušená (100% blastomery). Tato metoda je užitečná pro embrya i oocyty, ale ne pro spermie. Extrémní rychlost je vyžadována během procesu odskelnění (rozmrazování), odstranění vzorku z kapalného dusíku a jeho zavedení do středu při 37 ° C. Některé studie zdůrazňují, že tato rychlost rozmrazování může být důležitější než rychlost zmrazování pro dosažení vysoké míry přežití kryokonzervované oocyty.
| Kryonika | |
|---|---|
| Koncepty | |
| Lidé | |
| Organizace | |
| související témata | |
| Kategorie " Cryonics " | |