Kryoelektronová tomografie

Elektronická kryotomografie  ( ECT , také   kryoelektronová tomografie, kryo-ET nebo CET ) je trojrozměrná zobrazovací technika s vysokým rozlišením (~4 nm). Slouží k získání snímků biologických makromolekul a buněk [1] .

ECT se používá s  transmisní elektronovou mikroskopií (TEM), ve které jsou vzorky nakloněny pod různými úhly k elektronovému paprsku, což vede k sérii dvourozměrných snímků. Série 2D nakloněných snímků je zpracována v počítači a výsledkem je 3D tomogram.

Na rozdíl od technik využívajících  elektronovou tomografii se při této technice zkoumané vzorky zmrazují pomocí speciální technologie, aby studovaný předmět nebyl poškozen ledovými krystaly, tlakem, chemikáliemi a dalšími faktory. Tento postup se nazývá kryofixace. Obvykle se organický vzorek ochladí tak, aby vzniklý led byl amorfní (nekrystalický, proto se provádí vitrifikace) [2] , a prosvícení se provádí za kryogenních podmínek při teplotách pod °C, což zabraňuje destrukci biologických struktur [3] .

Popis technologie

V elektronové mikroskopii (EM) jsou vzorky ve vysokém vakuu. Takové vakuum je pro biologické vzorky nepoužitelné, protože voda v buňkách vře a ty explodují. Při pokojové teplotě v EM jsou vzorky dehydratovány. Dalším přístupem ke stabilizaci biologických vzorků je jejich zmrazení ( kryo-elektronová mikroskopie ). V kryo-elektronové mikroskopii se vzorky (obvykle malé buňky (jako jsou bakterie nebo Archaea ) nebo viry ) připravují pro vyšetření v normálních vodných médiích. Vzorky jsou ponořeny do kryogenu (obvykle tekutého etanu ), zatímco molekuly vody nemají čas se přeskupit do krystalové mřížky. V důsledku takového ochlazení přechází voda do stavu amorfního ledu. [2] Tím se zachovají buněčné struktury, jako jsou lipidové membrány, které jsou běžně zničeny konvenčním zmrazením. Zmrazené vzorky jsou skladovány při teplotě  kapalného dusíku a voda není dostatečně zahřátá, aby krystalizovala.

Vzorky jsou pozorovány v transmisním elektronovém mikroskopu (TEM). Jsou nakloněny v různých úhlech vzhledem k elektronovému paprsku (typicky každý 1 nebo 2 stupně od asi -60° do +60°), aby se vytvořily obrazy v každém úhlu. Série snímků se zpracuje na počítači a získá se trojrozměrný obraz zájmového objektu [4] . Výsledný obraz se nazývá tomogram nebo tomografická rekonstrukce.

Funkce

V transmisní elektronové mikroskopii (TEM) elektrony interagují s materiálem vzorku, takže rozlišení je omezeno jeho tloušťkou. Vzorky musí mít tloušťku alespoň ~500 nm, aby bylo dosaženo „makromolekulárního“ rozlišení (~4 nm). Z tohoto důvodu se většina výzkumu ECT zaměřila na studium purifikovaných makromolekulárních komplexů, virů a malých buněk, jako je mnoho bakteriálních druhů a Archaea .

Silná interakce elektronů s hmotou vede k anizotropním efektům. Když je vzorek nakloněn, elektronový paprsek interaguje s relativně velkou plochou průřezu. To vede k tomu, že v praxi úhly náklonu větší než 60-70° neposkytují mnoho informací, a proto se nepoužívají.

ECT také využívá kryofluorescenční mikroskopii [5] , světelnou mikroskopii (například kryo-Palm [6] ) a další techniky. Při těchto technikách se vzorek obsahující fluorescenčně značený protein zmrazí a prohlédne se pod světelným mikroskopem. V tomto případě musí být vzorek skladován při teplotách (pod -150°C). Fluorescenční signál je identifikován a vzorek je přenesen do cryo-ET pro vyšetření.

Viz také

Poznámky

  1. ↑ Gan, Lu; Jensen, Grant J. Elektronová tomografie buněk  (neurčitá)  // Quarterly Reviews of Biophysics. - 2012. - 1. února ( roč. 45 , č. 1 ). - S. 27-56 . — ISSN 1469-8994 . - doi : 10.1017/S0033583511000102 . — PMID 22082691 .
  2. ↑ 1 2 Archivovaná kopie . Získáno 8. října 2017. Archivováno z originálu dne 8. října 2017.
  3. ↑ Dubochet, J.; Adrian, M.; Chang, JJ; Homo, JC; Lepault, J.; McDowall, A.W.; Schultz, P. Kryo-elektronová mikroskopie vitrifikovaných vzorků  (neopr.)  // Čtvrtletní přehledy biofyziky. - 1988. - 1. května ( roč. 21 , č. 2 ). - S. 129-228 . — ISSN 0033-5835 . - doi : 10.1017/s0033583500004297 . — PMID 3043536 .
  4. ↑ Lucič, Vladan; Rigort, Alexandr; Baumeister, Wolfgang. Kryo-elektronová tomografie: výzva dělat strukturální biologii in situ  // The  Journal of Cell Biology : deník. - 2013. - 5. srpna ( roč. 202 , č. 3 ). - str. 407-419 . - ISSN 1540-8140 . - doi : 10.1083/jcb.201304193 . — PMID 23918936 .
  5. ↑ Zhang, Peijun. Korelativní kryo-elektronová tomografie a optická mikroskopie buněk  (anglicky)  // Current Opinion in Structural Biology : journal. - 2013. - 1. října ( roč. 23 , č. 5 ). - str. 763-770 . — ISSN 1879-033X . - doi : 10.1016/j.sbi.2013.07.017 . — PMID 23962486 .
  6. ↑ Chang, Yi-Wei. Korelovaná kryogenní fotoaktivovaná lokalizační mikroskopie a kryo-elektronová tomografie  (anglicky)  // Nature Methods  : journal. - 2014. - 1. července ( roč. 11 , č. 7 ). - str. 737-739 . — ISSN 1548-7105 . - doi : 10.1038/nmeth.2961 . — PMID 24813625 .

Externí odkazy