Metoda DNA komety

Aktuální verze stránky ještě nebyla zkontrolována zkušenými přispěvateli a může se výrazně lišit od verze recenzované 22. srpna 2020; ověření vyžaduje 1 úpravu . Vzhled a pořadí DNA komet:
Pět podmíněných typů komet DNA, které se berou v úvahu při analýze stupně poškození DNA

Metoda DNA komety  je metoda pro detekci poškození DNA a studium opravy na úrovni jednotlivých buněk. Metoda je schopna detekovat zlomy řetězců DNA v jednotlivých buňkách. Je rychlý a velmi citlivý [1] .

Historie

Za první úspěšnou zkušenost se studiem poškození DNA v jednotlivých buňkách je považována práce Rydberga a Johansona (1978) [2] . Následně byla metoda opakovaně upravována a zdokonalována za účelem jejího zjednodušení a zvýšení citlivosti detekce poškození buněčné DNA [2] .

Použitelnost

Metoda DNA komety je použitelná v systémech in vivo i in vitro . V současné době je metoda široce používána ve studiích genotoxicity ionizujícího záření , léčiv a průmyslových chemikálií, opravy DNA, apoptózy, klinických studií prenatální diagnostiky, náchylnosti k rakovině, terapie rakoviny, šedého zákalu. Tato metoda se postupně stává nedílnou součástí programů biomonitoringu:

Použití metody umožňuje vzít v úvahu heterogenitu komplexních populací, studovat výtěžnost poškození a opravy DNA v téměř všech eukaryotických buňkách. K analýze přitom stačí jen několik tisíc buněk testovaného vzorku [1] [3] .

Prohlášení o metodě

Imobilizace buněk vystavených zkoumanému faktoru se provádí v agaróze s nízkou teplotou tání nanesené na podložní sklíčko pro mikroskopii. Úprava vzorků v pufru s vysokým obsahem soli vede k lýze buněčných membrán a extrakci proteinů. Molekuly DNA jsou separovány elektroforézou, stopy DNA jsou vizualizovány barvením fluorescenčním barvivem a poté jsou vzorky zkoumány mikroskopicky. V přítomnosti zlomů DNA je narušena strukturní organizace chromatinu a dochází ke ztrátě supercoilingu DNA , což vede k relaxaci této biomakromolekuly a tvoří se fragmenty DNA, které nejsou spojeny s buňkou. V elektrickém poli jsou uvolněné smyčky a fragmenty DNA nataženy směrem k anodě, což dává pozorovaným objektům vzhled „komet“ (odtud název „ kometový test “, který se stal běžně používaným). Množství DNA migrující směrem k anodě a stanovené mikrofotometrem lze použít jako indikátor charakterizující úroveň poškození DNA ve studovaných buňkách. "Komety" jsou analyzovány buď vizuálním pozorováním a diferenciací "komet" podle stupně poškození DNA, nebo pomocí počítačového softwaru pro zpracování obrazu. Posledně jmenovaná metoda analýzy „komet“ je nezbytná zejména pro objektivní posouzení účinku malé koncentrace škodlivého činidla nebo pro identifikaci menších rozdílů mezi buněčnými subpopulacemi [1] .

Standardizace metod

V současné době většina laboratoří, které zavedly tento metodický přístup ve výzkumu, vyvinula četné varianty protokolu, zejména dobu trvání a podmínky buněčné lýzy, denaturace, elektroforézy a barvení DNA. Na jedné sklenici se spočítá 25-500 buněk v duplikátech. Výsledky experimentu jsou spolehlivé, pokud se opakují alespoň 6krát. Analýza DNA komet může být provedena vizuálně nebo pomocí softwarového a hardwarového komplexu. Ve vizuální analýze jsou komety DNA seřazeny do pěti podmíněných typů s odpovídající číselnou hodnotou od 0 do 4.

Výpočet indexů

Označení Charakteristický Výpočet

Index komety DNA (index komety DNA)

 — Stupeň poškození DNA Index DNA komet  se vypočítá
jako poměr součtu "DNA-komet" každého typu
k celkovému součtu spočítaných "DNA komet".
, kde  je počet „komet DNA“ každého typu a  - součet spočítaných "DNA-komet".

Zobrazovací a analytické programy

Viz také

Poznámky

  1. ↑ 1 2 3 Sorochinskaya, Michajlenko, 2008 , str. 303-309.
  2. ↑ 1 2 Rydberg B, Johanson KJ. Odhad zlomů řetězce DNA v jednotlivých savčích buňkách // Academic Press. - New York, 1978. - S. 465-468 .
  3. ↑ S. Cotelle a JF Ferard. Comet Assay in Genetic Ecotoxicology: A Review  // Environmental and Molecular Mutagenesis. - Wiley-Liss, 1999. - T. 34 . - S.: 246-25 . Archivováno z originálu 4. března 2016.

Literatura