Allium test

Allium test  je rostlinný testovací systém pro hodnocení mutagenních , mitózu modifikujících a toxických účinků chemických a fyzikálních faktorů na rostlině Allium cepa - cibule ( odrůda Stuttgarten ).

Test Allium využívá kořeny sazenic cibule Allium cepa , který byl poprvé navržen Královskou švédskou akademií věd jako standardní testovací objekt [1] [2] .

V moderním výzkumu je Allium cepa L. považována za referenční rostlinný testovací objekt pro analýzu mutagenity, mitotoxicity a toxicity různých faktorů [1] [3] . Spolu s Allium testem se používají i další testovací objekty (z rostlin jsou nejběžnější hrách Pisum sativum a fazole Vicia faba ).

Tato metoda je jednoduchá, ekonomická, rychlá a dostatečně citlivá, aby bylo možné určit, zda je faktor " mutagenní " nebo "nemutagenní", "cytotoxický" nebo "necytotoxický". [4] . Allium test se doporučuje pro studium téměř všech chemických, fyzikálních a biologických faktorů. Jak jsou syntetizovány nové látky, test dostává nová doporučení, díky čemuž je jedním z nejoblíbenějších.

Allium test doporučují odborníci WHO jako standard v cytogenetickém monitorování životního prostředí, protože výsledky získané tímto testem ukazují korelaci s testy na jiných organismech: řasách, rostlinách, hmyzu včetně savců a člověku [2] [5] [6] [7] [8] . Doporučeno jako alternativa ke genotoxikologickým testům na laboratorních zvířatech (v případě, že u stejných testovaných látek je v tomto testu a testech na zvířatech pozorován stejný výsledek, tedy pokud je prokázána korelace) [9]

Historie metody

Historie testovacího biotestu Allium začala před více než 70 lety. Autorem metodiky je akademik Královské švédské akademie věd Dr. Albert Levan (1905–1998). Známý pro své práce v oblasti cytogenetiky, genotoxikologie, onkogenetiky a také tím, že v roce 1956 spolu s Joe Hin Tio určil sadu lidských chromozomů [10] .

Albert Levan šel do tvorby Allium testu postupně. V letech 1929–1937 Levan studoval morfologii a sadu chromozomů u řady zástupců rodu Allium [11] [12] . Zároveň se řídil díly mnoha vynikajících vědců: Edwarda Regela, Eduarda Strasburgera, Heinricha Schaffnera [13] [14] , Georga Tischlera, Emila Heitze, Edmunda Wilsona, Michaila a Sergeje Navašinových, Grigorije Levického a mnoha dalších. . Na základě jejich práce a na základě své vlastní práce dospěl Albert Levan k závěru, že A. cepa je ideálním objektem pro podrobné cytogenetické studie. Hlavním důvodem volby bylo to, že tento druh má „výborný chromozomový stav“ [15] . Cibule rychle klíčí a jsou snadno dostupné po celý rok. Ke studiu mitózy si vybral kořenové meristémy [16] .

V roce 1937 vyšel v časopise Science senzační článek A. F. Blacksleyho a A. G. Averyho o nové metodě, která umožňuje získat cenné polyploidní rostliny po ošetření semen kolchicinem [17] . V témže roce byla v časopise Nature publikována práce B. R. Nebela, který nezávisle na sobě dospěl ke stejným závěrům [18] .

V roce 1938 Albert Levan, rozvíjející jejich myšlenky, provádí svůj vlastní výzkum. V několika sériích experimentů působil kolchicinem na kořenové meristémy A. cepa a registroval mitózu - buňky se výrazně zvětšily a počet chromozomů se znásobil. Vizuálním projevem mitózy, který pozoroval, bylo „nádorové“ ztluštění kořenových špiček [12] . V roce 1945 Levan publikoval článek v časopise Nature, ve kterém ukazuje, že soli 25 kovů jsou schopné vyvolat různé typy chromozomálních aberací v kořenových meristémech A. cepa. Studoval vliv expozice acenaftolu, chloroformu, kyselině naftalenové octové a mnoha dalším sloučeninám. V roce 1949 Albert Levan píše o nové metodě v cytogenetice a dává jí název Allium test. Raná verze metody zahrnovala pouze analýzu mitózy v profázích. V pozdějších pracích začal Albert Levan registrovat fragmenty a mosty a vyčlenil je jako samostatnou kategorii „radiomimetických efektů“ [15] [19] . Levan věřil, že výsledky získané v testu Allium jsou důležitým ukazatelem pro hlubší výzkum mutageneze a karcinogeneze [15] .

Spolu s Levanem přišli další vědci na myšlenku vytvořit testovací metodu Allium podobným způsobem. V roce 1941 studoval Karl Sachs z Harvardské univerzity vliv rentgenového záření na kořenové meristémy A. cepa a zaznamenal různé chromozomální abnormality [20] . V roce 1948 Francisco D'Amato z univerzity v Pise zjistil, že řada chemických sloučenin má mitotoxický účinek. D'Amato vyvinul „test sazenic cibule“ a spolu s kolegy zkoumal cytogenetické účinky více než 40 chemických látek [21] . V témže roce vyšel článek Leona Vanderlina (1948), který píše o mitózách v kořenových meristémech A. cepa jako o klasickém modelu mitózy v cytogenetice [22] .

V roce 1973 Královská švédská akademie věd doporučila Allium test jako standardní screeningový test. Důvodem byla jeho rychlost, hospodárnost a snadnost provedení, stejně jako „výborný stav chromozomů“ u A. cepa L. Podle W. Granta byl do roku 1982 studován genotoxický potenciál více než 148 chemických sloučenin. pomocí testovací metody Allium. Na základě toho V. Grant dochází k závěru, že je nutné zařadit Allium test do seznamu standardních genetických a toxikologických testů, které provedli odborníci WHO v roce 1985 [23]

V letech 1979-1985. G. Fiskesjo, student A. Levana, vyvíjí a upravuje metodu pro hodnocení různých chemických sloučenin. Velkou pozornost věnuje nejen zohlednění frekvence chromozomálních aberací, ale také měření délky kořenů, jako indikátoru toxického účinku zkoumaného faktoru, který přímo souvisí s mikroparametry. Fiskesjo poznamenává, že citlivost testu Allium je prakticky stejná jako citlivost testu na lidských lymfocytech [2] . Zde je jeho vlastní hodnocení této metody:

• Rostliny se snadno skladují a udržují, jsou široce dostupné a levné. Obecně je stav chromozomu rostlinných buněk dobrý, a proto poskytuje vysokou kvalitu za kontrolních podmínek.
• Biologický test Allium cepa je relativně rychlý, snadno proveditelný a vysoce citlivý a reprodukovatelný. Poskytuje také konzistentní výsledky s řadou dalších testovacích systémů.
• Jak makroskopické, tak mikroskopické efekty mají mezi sebou dobrou korelaci . Makroskopický efekt (omezení růstu kořenů) je nejcitlivějším parametrem. Inhibice růstu je důsledkem přímých nebo nepřímých škodlivých účinků. Mikroskopické vyšetření umožňuje posoudit poškození chromozomů a poruchy buněčného dělení a poskytuje tak další informace týkající se závažnosti, mechanismu genotoxického účinku nebo potenciální mutagenity.
• Kořenové buňky mají určité enzymy působící jako oxidázy, které přispívají k přeměně mnoha nemutagenních látek na mutagenní. Tento aktivační systém umožňuje detekovat ty chemikálie, které zvyšují svůj toxický účinek při metabolismu.
• Systém má širokou škálu aplikací, jako je kontrola chemické čistoty pitné vody, přírodní vody a průmyslových škod atd., a je užitečný pro hodnocení a klasifikaci chemických látek v životním prostředí s ohledem na toxicitu.
• Biotest lze také použít k měření relativní toxicity ve vodě nerozpustných sloučenin za předpokladu, že je lze rozpustit ve vhodném rozpouštědle a poté zředit ve vodě tak, aby zbytková koncentrace nepřekročila určité limity. V takových případech by měl být také organizován zkušební režim pro kontrolu rozpouštědel. Biotest pracuje v širokém rozmezí pH (3,5 - 11,0) bez zjevného vlivu na růst kořenového systému. Mírně kyselé/alkalické vzorky vody, chemické roztoky atd. lze tedy testovat bez nutné úpravy pH.
• Biotest využívající Allium cepa je vysoce citlivý a může mít pozitivní toxické účinky, pokud jsou testované vzorky testovány v jiných systémech (zejména vyšších organismech, jako jsou ryby) a jsou shledány jako netoxické. Pozitivní výsledky v tomto testovacím systému ukazují na potenciální biologické riziko. Extrapolace výsledků z jednoho zkušebního systému na druhý (a v konečném důsledku na člověka) by měla být založena na výsledcích série zkoušek as náležitým ohledem na metabolické cesty zkušebního vzorku.
• Ve srovnání s jinými krátkodobými alternativními biologickými testy toxicity tento test prokázal dobrou shodu s výsledky jiných testovacích systémů využívajících řadu dalších organismů, jak eukaryot, tak prokaryot. Výsledky takových srovnání jsou popsány níže [2] :

• V kruhovém testu, kde byly různé mikroorganismy použity jako testovací systémy nezávislými laboratořemi pro studium látek, byly stejné látky navrženy pro testování na Allium test-e. Mezi tyto mikroorganismy patří 16 různých mořských řas (zelené mořské řasy a řasy křemičité), kvasinky (Saccharomyces cerevisiae), prvoci (Tetrahymena pyriformis) a aktivované kalové mikroorganismy (společenstvo bakterií , kvasinek a prvoků). Výsledky byly obecně dobře srovnatelné, i když byly patrné určité rozdíly v citlivosti. Většina řas byla citlivější než Allium sulphur, zatímco test na kvasinky, prvoky a aktivovaný kal byl méně citlivý.
• Bylo zjištěno, že řada vodních rostlin a živočichů je méně citlivá na určité třídy látek ve srovnání s biologickým testem Allium, jako jsou ryby ( Gasterosteus aculeatus ), vodní živočichové ( Daphnia magna , Brachydario rerio  - vejce nebo kaviár bakterií Microtox) a rostliny ( jednobuněčné řasy). Jiná zvířata (např . Nitocra spinipes ) a rostliny (např. řasy a jednobuněčné organismy) vykazují srovnatelné výsledky s dotyčným biologickým testem
• Ve studiích na benzopyrenu je čínský systém využívající křeččí buňky V79 bez zohlednění metabolických účinků aktivačního systému méně citlivý než Allium cepa . Změny relativní citlivosti s ohledem na vliv oxidázových funkcí. Přes změny v citlivosti jsou celkové výsledky mezi oběma systémy srovnatelné.
• Testy prováděné na lidských lymfocytech , které se ukázaly být o něco citlivější na účinky organických sloučenin rtuti než buňky meristémů kořene Allium cepa , jsou obecně stejného typu. Je třeba také poznamenat, že studium mikroskopických parametrů obou buněk poskytuje podobný účinek (c- mitóza ).
• Biotestování se sírou Allium je v tomto případě nejlepší metodou pro stanovení rizika pro životní prostředí díky své vysoké citlivosti.

J. Rank a M.G. Nelson (1993) navrhl modifikaci antelofázové analýzy, která identifikuje tři typy chromozomálních abnormalit: fragmenty, můstky a chromozomové zpoždění. Autoři doporučili používat cibule A. cepa cv. Stuttgarten-Riesen [24] . J. Rank (2003) ukazuje 82% korelaci mezi citlivostí testu Allium a testu na hlodavcích vůči chemikáliím (zejména pesticidům). Poznamenává také, že citlivost Allium testu při studiu odpadních vod je vyšší než u Amesova testu [25] .

V roce 1995 T.-H. Ma navrhl modifikaci, ve které byl mutagenní účinek odhadnut s ohledem na frekvenci mikrojader [26] . Společnou analýzu chromozomových aberací a mikrojader navrhli D. M. Leme a M. A. Marin Morales (2008) jako zásadní indikátor přímého účinku chemického faktoru na DNA [27] . Podobnou metodu navrhli v roce 2013 D. S. Pesnya a A. V. Romanovsky k posouzení genotoxických a cytotoxických účinků elektromagnetického záření [28] . Statistickou standardizaci Allium testu provedli A. Barberio et al. (2011). Analyzovali více než 50 studií, které byly provedeny pomocí testovací metodologie Allium. Na základě analýzy těchto dat autoři doporučili pro každou sérii experimentů použít vzorek 3 cibulí, 3 kořenů z každé [29] .

Využití „moderní“ verze testu Allium v ​​kombinaci s metodou DNA komety k posouzení genetického poškození je stále populárnější. Metoda byla navržena v roce 1997 Navarrete et al [30] . Později bylo zjištěno, že v testu Allium je citlivost metody DNA komety, antelofázové analýzy a mikronukleárního testu stejná, protože dávají pozitivní výsledek při testování stejných látek [31] [32] . Pro posouzení genotoxického potenciálu přímých a nepřímých mutagenů se doporučuje použití metody DNA komety v testu Allium [33] .

V současné době se termín Allium test používá spolu se stále větším počtem objektů a zároveň je i nadále jedním z nejlepších testovacích objektů pro analýzu genotoxicity různých faktorů.

Výhody

Výhody rostlinného testovacího systému Allium cepa . Výhody testu Allium oproti jiným metodám

Tato metoda nevyžaduje znalost karyotypu a identifikaci typů poškození chromozomů, je jednoduchá, ekonomická a dostatečně citlivá na stanovení „mutagenního“ nebo „nemutagenního“ faktoru [4] .

Metoda umožňuje registrovat chromozomální mutace , jako jsou delece a translokace, které vedou k přítomnosti můstků a fragmentů v ana- a telofázi . Metoda umožňuje detekovat změny v chování chromozomů na dělicím vřeténku [4] . Allium test je ideální pro testování mikrojader.

• Známý a rozšířený Amesův test z hlediska citlivosti a spolehlivosti výsledků je v hodnocení znečištění výrazně horší než Allium test [34] . Kromě toho byl test Allium doporučen pro testování vzorků různých nanomateriálů, zatímco Amesův test se ukázal jako nepřijatelný kvůli falešně negativním výsledkům [35] .
• Studie mutagenních vlastností nanočástic oxidu titaničitého na meristémech kořene Allium cepa a lidských lymfocytech ukázala, že oba testy vykazují podobnou citlivost na tuto látku [36] .
• Při studiu genotoxického potenciálu sloučenin niklu se ukázalo, že Allium test je na ně také vysoce citlivý, jako jsou lidské lymfocyty a fibroblasty [37] .

Výhody zeleninových testovacích systémů na příkladu cibule Allium cepa

Testovací systémy rostlin jsou nyní stále běžnější při hodnocení mutagenního znečištění životního prostředí . To je způsobeno řadou výhod rostlin jako indikátorů genotoxicity různých faktorů a také signálních objektů v genetickém monitorování stavu životního prostředí:

• Rostliny jsou neměnným objektem pro přírodní studie antropogenního vlivu na životní prostředí: jsou první, kdo přebírá vliv znečišťujících látek, nemigrují jako zvířata, což umožňuje přesně vypočítat dobu expozice.
• Rostliny jsou eukaryotické organismy , takže na rozdíl od mikroorganismů na nich lze zaznamenat všechny typy genetického poškození:

• genetický,
• chromozóm,
• genomický.

• Metody práce s rostlinnými objekty jsou ekonomické, vyžadují minimální množství zařízení a činidel , pěstování rostlin je méně pracné než pěstování zvířat [38] .
• Můžete získat materiál požadovaných fází.
• Experimenty lze provádět za přísně kontrolovaných podmínek - jak v akutních, tak i chronických experimentech (od několika hodin až po několik let).
• Údaje o mutagenezi řady faktorů v rostlinných objektech vykazují dobrou korelaci s výsledky testování na zvířatech.
• Rostliny umožňují registrovat přímé i nepřímé mutageny.
• Pouze rostliny umožňují identifikovat tak důležitou třídu mutagenů, jako jsou chemické sloučeniny , které získávají mutagenitu v procesu metabolické aktivace rostlinnými enzymy .
• Některé faktory, jejichž vysoká toxicita znemožňuje zohlednit genetické poškození u zvířat, lze jako mutageny hodnotit pouze v rostlinných testovacích systémech.
• Rostliny lze pěstovat přímo v místě posouzení celkového genetického efektu kontaminace stanovených ploch [39] .
• Údaje získané z testovacích systémů rostlin vykazují dobrou korelaci s údaji z testů na savcích. Vyšší rostliny se navíc v ekosystému projevují jako stabilní biosenzor a umožňují tak sledovat vývoj genotoxického účinku (v případě, že faktor vykazuje mutagenní účinek současně na rostlinné i živočišné testované objekty) [40] .

Charakteristika cibule Allium cepa L., použitelnost v testech

Allium cepa L. (divize Angiospermae , třída Liliopsida , podtřída Lilidae , řád Liliales , čeleď Alliaceae , rod Allium L. ) jako testovací objekt je široce používán pro hodnocení genetického potenciálu[ neznámý pojem ] chemické sloučeniny, přírodní a odpadní vody [3] . Cibule má 16 dobře obarvených chromozomů (2n=16) [38] . Délka buněčného cyklu je přibližně 17,8 hodiny [41] . Mitotický index může kolísat v různých kořenech stejné rostliny, ale zprůměrovaná data jsou poměrně stabilní. Trvání mitózy v různých kořenových tkáních Allium cepa je stejné a nemění se po délce kořene. Poměr různých fází mitózy nezávisí na době fixace.

Testy pomocí meristematických pletiv sazenic kořenů cibule umožňují registrovat toxické (růst kořenů), mitózu modifikující (zhoršená mitotická aktivita meristému, patologie vřeténka ) a mutagenní účinky (indukce mikrojader a chromozomových mutací) [3] .

Nejčastěji používaná analýza frekvence chromozomových aberací v ana - telofázi mitózy (antelofázový test) . Tento test registruje chromozomální mutace, jako jsou delece a translokace, stejně jako porušení dělicího vřeténka z hlediska frekvence chromozomového opoždění, multipolárních a asymetrických mitóz. Anatelofázová metoda využívající cibuli jako testovací objekt se doporučuje jako testovací objekt pro přírodní prostředí. Při srovnání mutagenní aktivity chemických polutantů stanovené v jiných toxikogenetických testech s antelofázovou metodou bylo zjištěno, že její citlivost je vysoká a činí 82 %.

Zohlednění pouze chromozomálních aberací však může vést k podcenění skutečného genotoxického účinku např. z následujících důvodů. Za prvé, tyto metody neumožňují registraci genových mutací, které se vyskytují mnohem častěji než chromozomální. Za druhé, chromozomální mutace jsou detekovány zpravidla na pozadí vysoké mitotické aktivity meristematických buněk. Zvýšená toxicita faktorů prostředí může způsobit pokles počtu dělících se buněk v důsledku zpoždění buněčného cyklu v kontrolních bodech nebo odumření některých buněk, proto se uměle sníží i frekvence zaznamenaných chromozomálních poškození.

Kontrolní body buněčného cyklu (kontrolní body) jsou období cyklu, kde se kontroluje přesnost předchozí fáze. Tento mechanismus chrání dělící se buňky před smrtelnou mitózou zastavením dělení a poskytnutím času opravnému systému na opravu poškození DNA. Když kontrolní mechanismus detekuje poškozenou nebo nereplikovanou DNA, dochází ke zpoždění v buněčném cyklu, během kterého dochází k úpravě. Řídicími body jsou přechody G1-S a G2 -M. Existuje také specifický bod kontroly při přechodu z metafáze do anafáze . Nárůst počtu poruch pod vlivem genotoxických látek vede ke zpoždění buněčného cyklu v kontrolních bodech, což ovlivňuje počet dělících se buněk a délku fází buněčného cyklu.

V důsledku toho je pro snížení možných falešně negativních odpovědí při detekci genotoxických a karcinogenních faktorů vhodné použít takový indikátor, jako je mitóza modifikující aktivita studovaného faktoru, která je určena úrovní mitotické aktivity tkáně a relativní trvání fází mitózy. Studium aktivity modifikující mitózu umožňuje identifikovat časné změny v cytogenetickém systému těla způsobené komplexem různých poruch.

Účinek modifikující mitózu v meristému kořene rostliny je studován souběžně se stanovením frekvence chromozomových aberací. V důsledku toho lze v jednom testu zaregistrovat širokou škálu poruch genetických struktur a genetických procesů, což zjednodušuje studium a snižuje náklady na jeho provedení [42] .

Použití rostlinného testovacího systému tedy umožňuje nejen říci o kvantitativním dopadu studovaného faktoru na živý objekt, ale také určit povahu dopadu na postižené oblasti genetického materiálu.

Pro testování jsou vhodné faktory různé povahy (viz tabulka):

Metodika testování

Příprava zařízení pro testování

Petriho misky, odměrné válce (25 a 100 ml), penicilinové lahvičky nebo podobné nádoby o objemu 20 ml s hlubokým dnem, podložní a krycí sklíčka, lahvičky (15, 25 a 100 ml), odměrné pipety (1,0; 2,0; 10,0), oční pipety, stereoskopické lupy MBS-9, mikroskopy [62] .

Chemická činidla

acetoorcein 2 %	2 g horceinu se rozpustí ve 100 ml horké 45% kyseliny octové, přivedou k tajnému varu (nepřípustný var) a přefiltrují. Používá se pro barvení hřbetů
Clark Retainer	směs 96% ethylalkoholu a ledové kyseliny octové v poměru 3:1. Používá se k fixaci kořenů.
Alkohol 70%	směs 96% ethylalkoholu a destilované vody. Používá se pro dlouhodobé skladování
Kyselina octová 40-45%	směs ledové kyseliny octové a destilované vody. Používá se k přípravě léků

Příprava materiálu

Příprava žárovky

Vyberte žárovky pro výzkum. Vzorek by měl být homogenní jak v kontrolní, tak v experimentální variantě experimentu. Průměrná hmotnost sady je 10-20 g, průměr 1,5-2 cm.Vybrané cibule by neměly být přesušené. To lze pochopit odstraněním přebytečné slupky, která navíc může rušit experiment. Před začátkem pokusu by cibulky neměly vyrašit zelené výhonky listů.

Příprava a testování faktoru mutageneze

Existují dvě varianty testu Allium: původní a upravený:

• V původní verzi testu se cibulky umístí do čisté vody, aby vyklíčily kořeny (pozn. autor povoluje použití vody z vodovodu. Je třeba vzít v úvahu skutečnost, že ve Švédsku, odkud autor pochází, voda z vodovodu je opravdu velmi čistá. Případně můžete použít čištěnou pitnou vodu s nízkou salinitou). Když kořeny dosáhnou 1-2 cm, přemístíme cibule na určitou dobu do nádob s testovacím roztokem (od 2 hodin v případě roztoku kolchicinu do 3 dnů). Původní verze je nejvhodnější při testování fyzikálních faktorů.
• V upravené verzi testu se cibule umístí přímo do testovacího roztoku bez předchozího klíčení kořenů. Tato možnost se častěji používá při testování chemických látek [62] .

Pro čistotu experimentu je přípustné použít destilovanou vodu. V tomto případě bude cibulka růst díky vnitřním zásobám živin během experimentu, aniž by došlo k depresi. V experimentech, kde se zkoumají chemicky aktivní látky, je výhodné použít destilovanou vodu, aby se zabránilo tvorbě dalších sloučenin. Zde je omezení, že destilovaná voda je fyziologicky závadná a v řadě dalších testů je její použití obtížné. Nicméně jak v kontrole, tak v experimentu bude v tomto případě poškození destilovanou vodou považováno za stejné, stejně jako ostatní podmínky pozadí.
Cibule vyklíčí za 3 až 4 dny. Vhodné je používat nádoby o průměru 1,5 cm a výšce 10 cm, aby se kořeny při růstu neopíraly o dno nádoby, ve které se nacházejí. V opačném případě může dojít k některým biologickým účinkům – reakci meristému na překážku. Pro provedení antelofázové analýzy se odebere část páteře dlouhá asi 1 cm a provede se fixační procedura (pro dlouhodobé uložení). Kořeny se v případě potřeby omyjí z fixačního prostředku ve vodě, poté se obarví acetorceinem podle standardní metody. Pro mikroskopii se používá kořenový hrot dlouhý 1-2 mm - zóna aktivního dělení meristematických buněk.

Zpracování materiálu po experimentu Oprava

Pro fixaci jsou kořeny umístěny v nádobách s Clarkovým fixativem (viz výše). Nádoby jsou hermeticky uzavřeny a ponechány fixovat buňky po dobu 1-2 dnů. Poté se materiál dvakrát vymyje z fixativu v 70% lihu a umístí se do nádob se 70% lihem k dlouhodobému skladování. Alkohol by měl převyšovat objem materiálu 4-5krát. [63] [64] [65]

Barvení materiálu

Kořeny se barví 2% acetoorceinem (viz výše). Kořeny se omyjí od alkoholu ve vodě (vhodně v Petriho miskách). Materiál se přenáší do malých porcelánových kelímků s držákem, které jsou ze 2/3 naplněny barvivem. Kelímek je přikryt podložním sklem. Zahřátý nad plamenem alkoholů k tajnému varu (zamlžení krycího sklíčka). Kelímek s materiálem je ponechán po určitou dobu, aby se obarvily chromozomy (od 2 hodin do 1 dne). Poté lze připravit preparáty pro mikroskopii. [66]

Způsob přípravy preparátů pro mikroskopickou analýzu

Připravte dočasné drcené přípravky z kořenových meristémů. K tomu se hrot meristému o délce 2-3 mm odřízne od obarveného kořene čepelí (hrot se liší tmavší barvou a ztluštěním), položí se na podložní sklíčko v kapce 45% kyseliny octové, zakryje se s krycím sklíčkem a jemně rozdrcené zápalkou, aby se získala monovrstva buněk. Preparáty se analyzují pod mikroskopem při zvětšení 12,5 x 1,5 x 40. Na preparátech jsou uvažovány malé kulaté čtvercové buňky s dobře obarvenými jádry a neporušenými buněčnými stěnami. [63]

Screeningový test

Před genetickou analýzou by měl být proveden úvodní screeningový test, který okamžitě ukáže, zda má faktor výraznou biologickou aktivitu. Hlavním a nejdůležitějším zkoumaným makroparametrem je růst kořenů. Ale kromě toho lze studovat i další parametry:

• Turgescence. Tvrdost kořenových špiček souvisí se stupněm toxicity faktoru. Při vysoké toxicitě faktoru se turescence snižuje, což může vést k odumírání kořenů.
• Změna barvy. Během pokusu se může změnit barva kůry a důvodem je obsah některých solí ve vodě (například modrozelené ze síranu měďnatého). Špičky kořenů navíc mohou zhnědnout, což souvisí s toxickým účinkem faktoru, který způsobuje buněčnou smrt.

Standardně se kontrolují následující parametry:

• Tvar kořene. Otok kořenových špiček po 4-5 dnech expozice ukazuje na zvláštní typ poruchy c-mitózy. K ohnutí kořenů nebo jejich špiček obvykle dochází po vystavení roztokům určitých solí.
• Délka kořene. Jedná se o hodnotu průměrné délky kořenů (pro 1 žárovku).

Metoda pro měření délky kořenů

Délku kořene lze měřit dvěma způsoby:

• Obvykle se délka kořenového systému měří mimo nádobu svinovacím metrem (měření pro každou cibulku). Tím se zaznamená maximální dosažená délka kořene (bez kratších kořenů) pro každou cibuli. Poté se vypočítá průměr pro celý vzorek žárovek (od 3 do 5 kusů) v experimentu. Tato metoda umožňuje provádět měření během experimentu.
• Druhý způsob je přesnější. Na konci experimentu se kořeny odříznou u základny cibule, změří se délka každého kořene a vypočítá se průměrná hodnota (průměrná hodnota pro každou cibulku). Poškozené kořeny se neberou v úvahu. Poté se stanoví průměrná hodnota délky kořenů pro celý vzorek cibulí.

Výpočet parametru růstu kořene

Lze provést dvěma způsoby:

• Průměrná délka kořenů se vypočítá pro každou cibulku v experimentální a kontrolní sérii experimentů. Poté se vypočítá celková průměrná hodnota délky pro experimentální sérii a kontrolu. Vypočítá se, kolikrát je délka kořenů v experimentální sérii větší/menší než u kontroly, a vyjadřuje se v procentech. Statistické zpracování výsledků se provádí pomocí analýzy rozptylu a/nebo Studentova t- testu .
• Průměr je možné vypočítat najednou jako celek pro každou variantu experimentu (tedy bez výpočtu průměrné hodnoty pro konkrétní žárovku, protože celá skupina žárovek byla v homogenních podmínkách). Pro srovnání celkových vzorků pro experiment a kontrolu můžete použít analýzu rozptylu a Studentův t-test.

Změna délky kořene v testu Allium je indikátorem toxicity. Jedná se o velmi citlivý indikátor, který se snadno vizuálně zaznamenává a nevyžaduje žádná speciální činidla a zařízení, dobře koreluje s mikroskopickými parametry, a proto je navržen jako krátkodobý screeningový test. Pokud dojde k výrazné inhibici růstu kořenů ve srovnání s kontrolou, pak se zaznamená toxický účinek ovlivňujícího faktoru. V případě výrazného nárůstu kořenů hovoří o stimulačním účinku.

Mikroskopická vyšetření a statistické zpracování

Výpočet rychlosti mutace

V Allium testu se k výpočtu frekvence mutací tradičně používá metoda anatelofázové analýzy frekvence chromozomových aberací. V antelofázi jsou registrovány mutace spojené s hrubým porušením struktury chromozomů, stejně jako s poškozením mitotického vřeténka (vřeténka) nebo změnou chování chromozomů na vřeténku [ 67] :

• zaostávající chromozomy,
• aberantní mitózy:
  • tripolární mitózy,
  • kvadripolární mitózy,
  • asymetrické (asymetrické) mitózy [38] .

Doporučení

Při hodnocení mutagenní aktivity chemikálií stačí použít pouze antelofázovou analýzu , tedy registrovat mutace ve fázích mitózy, protože meristémy jsou po celou dobu experimentu v kontaktu s ovlivňujícím faktorem. Ale při studiu mutagenní aktivity EMR se to ukázalo jako nedostatečné, protože kořenové meristémy jsou vystaveny záření pouze po určitou dobu. V intervalech mezi ozářeními probíhá transformace chromozomálních fragmentů indukovaná v anafázi a telofázi - buňky opouštějí mitózu a přecházejí do interfáze a z fragmentů se stávají mikrojádra. Výsledkem je, že tyto mutace zůstávají nezodpovězené. V tomto ohledu byla navržena modifikace testovací metody Allium, která umožňuje zohlednit celý součet mutací. U jednoho preparátu bylo doporučeno použít antelofázovou analýzu a mikronukleární test. V tomto případě je analyzován celý soubor buněk (dělících se i nedělících se), což zabraňuje falešně negativním odpovědím a poskytuje spolehlivější výsledky [45] .

Výpočet mitotických a fázových indexů

Výpočet mitotických indexů lze provést na stejných preparátech jako antelofázová analýza . Zobrazeno od 400 do 600 buněk (více - lépe). Spočítá se celkový počet dělicích se buněk a jednotlivých buněk v různých stádiích mitózy .

Označení fáze / indexu	Charakteristický	Výpočet indexu
/ MI	MI, % — mitotický index Mitotický index  je procento dělících se buněk z celkového počtu analyzovaných buněk.	, kde (P+M+A+T)  je součet buněk v profázi , metafázi , ana- a telofázi a N  je celkový počet analyzovaných buněk.
P / PI [68]	profáze ( profáze ) PI, %  - profázový index Index profáze  - procento buněk v profázi mitózy z celkového počtu analyzovaných buněk	, kde (P+M+A+T)  je součet buněk v profázi , metafázi , ana- a telofázi a P  je počet profází ve vypočítaných buňkách
M / MI [68]	metafáze ( metafáze ) MI, %  — metafázový index Index metafáze  - procento buněk v metafázi mitózy z celkového počtu analyzovaných buněk	, kde (P+M+A+T)  je součet buněk ve stadiu profáze , metafáze , ana- a telofáze a M  je počet metafází ve vypočítaných buňkách
A / AI	anafáze ( anafáze ) AI, %  — index anafáze Anaphase index  - procento buněk v anafázi mitózy z celkového počtu analyzovaných buněk	, kde (P + M + A + T)  je součet buněk ve stadiu profáze , metafáze , ana- a telofáze a A  je počet anafází ve vypočítaných buňkách
T / TI	telofáze ( telofáze ) TI, %  — index telofáze Telofázový index  - procento buněk v telofázi mitózy z celkového počtu analyzovaných buněk	, kde (P+M+A+T)  je součet buněk v profázi , metafázi , ana- a telofázi a T  je počet telofází ve vypočítaných buňkách
A-T / A-TI	ana-telofáze A-TI, % — index  ana- telofáze Anatelofázový index  je procento buněk v anafázi a telofázi mitózy z celkového počtu analyzovaných buněk	, kde (P + M + A + T)  je součet buněk ve fázi profáze , metafáze , ana- a telofáze a A + T  je počet ana- a telofází ve vypočítaných buňkách

Statistické zpracování dat

Statistické metody

Průměrný

Každá páteř je variantou. Pokud je opce menší než 30, měli byste použít přímou metodu: všechny opce se sečtou a výsledná částka se vydělí počtem opcí:

, kde Σ X  je součet variant, n  je dále počet analyzovaných variant (kořeny, mikroskopické preparáty).

Získaná integrální data o fázových indexech jsou podrobena statistickému zpracování. Zpracování se provádí podle vzorců pro malé vzorky (viz aritmetický průměr) .

Směrodatná odchylka σ

Pro malé vzorky se σ vypočítá podle vzorce:

Směrodatná odchylka (σ) je charakterizována řadou znaků. Bere v úvahu odchylku od aritmetického průměru každé možnosti. Proto je σ nejlepším indikátorem rozmanitosti znaků.

Průměrná chyba pro odhad spolehlivosti aritmetického průměru

Pro malé vzorky:

, kde m  je chyba průměru, σ je směrodatná odchylka

Aritmetické průměry charakterizující účinek studované látky na mitotickou aktivitu buněk meristémů Allium cepa byly vypočteny pro malý počet opakování. Spolehlivost pro celou populaci se stanoví pomocí střední chyby ( m ).

Hodnota průměrné chyby je nepřímo úměrná n. Čím více opakování experimentu se tedy zkoumá, tím menší je chyba X . Hodnota X by měla být zapsána s hodnotou její chyby:

Označení	Příklad	Zobrazení grafu
	5±0,5%

Počet stupňů volnosti

Hledání ukazatele spolehlivosti rozdílu se provádí v několika fázích. Vypočítá se počet stupňů volnosti .

Studentův t-test
, kde X 0  je aritmetický průměr experimentální varianty, X k  je aritmetický průměr kontrolní varianty, S d  je chyba odchylky, která je určena při n 1 n 2

Dále byste měli porovnat vypočítané aritmetické střední hodnoty indexu (ukazatele) kontrolních a experimentálních možností. X ze dvou porovnávaných skupin, i když se jedná o stejnou obecnou populaci, se může vždy do určité míry lišit. Proč zjišťujeme, zda jsou rozdíly mezi aritmetickými průměry kontrolní a experimentální varianty významné, nebo zda je tento rozdíl náhodný. K objasnění otázky můžete použít Studentův t-test .

Chyba odchylky pro n 1 ≠ n 2pokud n 1 = n 2

Více podrobností v manuálu. [69]

Programově-statistické metody

Provádí se pomocí matematických balíčků ( Statistica , MS Excel , LibreOffice Calc atd . ). Pro statistickou analýzu dat získaných metodou Allium testu (frekvence chromozomových aberací a mikrojader , fázové indexy atd.) lze použít samokalkulující tabulkový procesor kompatibilní s MS Excel nebo LO Calc .

Tabulka má schopnost efektivně seskupovat data na listu, poskytovat výstupní data ve formě vhodné pro další zpracování a použití, stejně jako v budoucnu pro zvýšení funkčnosti tabulky pro konkrétní úlohy nebo při rozšíření vypočítaných testovacích parametrů [ 70] .

Viz také

• Chromozomální přestavby
  • Anatelofázová analýza
  • Metafázová analýza
  • Metoda DNA komety
  • mikronukleový test
• Mitóza
  • Mitotický index
• Vicia test

Poznámky

1. ↑ 1 2 Arefiev V.A., Lisovenko L.A. Anglicko-ruský výkladový slovník genetických termínů. - VNIRO, 1995. - 407 s.
2. ↑ 1 2 3 4 Fiskesjo G. Allium Test jako standard v monitorování životního prostředí  // Hereditas. - 1985. - Sv. 102. - S. 99-112.
3. ↑ 1 2 3 Sharma CB Rostlinné meristémy jako monitory genetické toxicity environmentálních chemikálií // Současná věda. - 1983. - T. 52 , č. 81 . - S. 1000-1002 .
4. ↑ 1 2 3 Prokhorova I. M., Fomicheva P. N., Kovaleva M. I. et al . Kotorosl a jezero. Nero // Moderní problémy biologie, ekologie, chemie: Regionální sborník vědeckých prací. - Jaroslavl, 2005. - S. 118-119 .
5. ↑ Constantin MJ, Owens ET Úvod a perspektivy rostlinného genetického a cytogenetického testu // Mutat. Res.. - 1982. - S. 1-12 .
6. ↑ KDO. Monografie Světové zdravotnické organizace o vybraných léčivých rostlinách // Světová zdravotnická organizace. - Ženeva, 1999. - T. 1 .
7. ↑ 1 2 Magda I. Soliman. Testování genotoxicity rostliny neem (Azadirachta indica A. Juss) pomocí testu chromozomové aberace Allium cepa  // Biological Science. - Asijská síť pro vědecké informace, 2001. - č. 1(11) . - S. 1021-1027 . Archivováno z originálu 4. března 2016.
8. ↑ Cotelle S., Masfaraud JF, Férard JF Hodnocení genotoxicity kontaminované půdy pomocí testů Allium/Vicia-micronucleus a Tradescantia-micronucleus  // Mutat. Res.. - Elsevier BV, 1999. - č. 426 (2) . - S. 167-171 . Archivováno z originálu 22. února 2014.
9. ↑ 1 2 Abu, Ngozi E. a Mba, KC Testování mutagenity farmaceutických odpadních vod na meristémech kořene Allium cepa  // Toxikologie a environmentální zdravotní vědy. - Akademické časopisy, 2011. - č. 3(2) . - S. 44-51 . Archivováno z originálu 13. září 2020.
10. ↑ Joe Hin Tio, Levan A. Počet chromozomů člověka // Heredias. - 1956. - č. 42 . - S. 1-6 .
11. ↑ A. Levan. Zahil und Anordnung der Chromosomen in der Meiosis von Allium // Heredias. - 1929. - Č. 13 . - S. 80-86 .
12. ↑ 1 2 A. Levan. Účinek kolchicinu na kořenové mitózy v Allium // Heredias. - 1938. - č. 24 . - S. 9-26 .
13. ↑ JOHN HENRY SCHAFFNER. Povaha a distribuce přitažlivých koulí a centrosomů v rostlinných buňkách  // Bot. Plyn. - 1894. - Č. 19 . -S . 445-459 . _
14. ↑ JOHN HENRY SCHAFFNER. Karyokineze v kořenových špičkách Allium cepa  // Bot. Plyn. - 1898. - Č. 26 . - S. 225-238 .
15. ↑ 1 2 3 A. Levan. Vliv chemikálií na chromozomy a mitózu, jak je studován testem Allium // Heredias. - 1949. - č. 35 . - S. 325-337 .
16. ↑ A. Levan. Cytologické studie v Allium. Předběžná poznámka // Heredias. - 1931. - č. 15 . - S. 347-356 .
17. ↑ Blakeslee AF, Avery AG Metody indukce zdvojení chromozomů v rostlinách ošetřením kolchicinem   // Věda . - 1937. - Ne. 86 . — S. 408 .
18. ↑ Nebel, B. R. Mechanismus polyploidie prostřednictvím kolchicinu   // Příroda . - 1937. - Ne. 140 . — S. 1101 .
19. ↑ 12 ALBERT LEVAN. Cytologické reakce vyvolané roztoky anorganických solí   // Nature . - London: Nature Publishing Group, 1945. - No. 156 . - str. 751-752 .
20. ↑ 12 Karl Sax . Chování chromozomálních aberací indukovaných rentgenovým zářením v buňkách kořenové špičky Allium  // Getetics: článek. - Harvardská univerzita, 1941. - č. 26(4) . - S. 418-425 . Archivováno z originálu 23. ledna 2022.
21. ↑ D`Amato F. Kvantitativní studie mitotických jedů testem Allium Cepa: Data a problémy // Protoplasma. - 1949. - č. 39 . - S. 423-433 .
22. ↑ Vanderlyn L. Somatická mitóza v kořenové špičce Allium cepa – přehled a reorientace // The Botanical Review. - 1948. - č. 14 . - S. 270-318 .
23. ↑ Grant WF Chromozom aberation assays v Allium // Mutat. Res.. - 1982. - č. 99 . - S. 273-291 .
24. ↑ Rank J., Nielsen MH Modifikovaný Allium test jako nástroj pro screening genotoxicity komplexních směsí // Hereditas. - 1993. - č. 18 . - S. 49-53 .
25. ↑ Pořadí J. Metoda Allium anaphase-telophase chromozom aberation assay // Ekologija. - 2003. - č. 418 . - S. 38-42 .
26. ↑ Ma T.-H., Xu Z., Xu C., McConnell H. Vylepšený test Allium/Vicia root tip micronucleus na klastogenicitu environmentálních polutantů // Mutat. Res.. - 1995. - č. 334 . - S. 185-195 .
27. ↑ Leme DM, Marin-Morales MA Chromozomová aberace a frekvence mikrojader v buňkách Allium cepa vystavených vodě znečištěné ropou – případová studie // Mutat. Res.. - 2008. - č. 650 . - S. 80-86 .
28. ↑ 1 2 3 Dmitrij S. Pesnya, Anton V. Romanovsky. Porovnání cytotoxických a genotoxických účinků alfa částic plutonia-239 a záření mobilního telefonu GSM 900 v testu Allium cepa . - Výzkum mutací, 2013. - č. 750 . - S. 27-33 . Archivováno z originálu 3. listopadu 2012.
29. ↑ 1 2 Barberio A, Barros L, Voltolini JC, Mello ML. Hodnocení cytotoxického a genotoxického potenciálu vody z řeky Paraíba do Sul v Brazílii pomocí testu Allium cepa L.  // Braz. J. Biol.. - 2009. - č. 69(3) . - S. 837-842 . Archivováno z originálu 9. července 2013.
30. ↑ Navarrete, MH, Carrera, P., De Miguel, M., De la Torre, C. Varianta testu rychlé komety pro buňky pevné tkáně. Hodnocení poškození DNA u vyšších rostlin // Mutat. Res.. - 1997. - č. 389 . - S. 271-277 .
31. ↑ Seth CS, Misra V., Chauhan LKS, Singh RR Genotoxicita kadmia na buňkách kořenového meristému Allium cepa: přístup k cytogenetickému a kometovému testu // Ecotox. a Environ. Saf.. - 2008. - č. 71 . - S. 711-716 .
32. ↑ Yildiza M., Ciğerci IH, Konuk M., Fidan AF Stanovení genotoxických účinků síranu měďnatého a chloridu kobaltnatého v buňkách kořenů Allium cepa pomocí chromozomových aberací a kometových testů // Chemosph.. - 2009. - No. 375 . - S. 934-938 .
33. ↑ Bandyopadhyay A., Mukherjee A. Citlivost Allium a Nicotiana v buněčných a acelulárních kometových testech k posouzení rozdílné genotoxicity přímo a nepřímo působících mutagenů // Ecotox. a Environ. Saf.. - 2011. - č. 74 . - S. 860-865 .
34. ↑ J. Kwasniewska, G. NaŁęcz-Jawecki, A. Skrzypczak, G. PŁaza, M. Matejczyk. Hodnocení genotoxických účinků výluhů ze skládek pomocí bakteriálních a rostlinných testů . - Ekotoxikologie a bezpečnost životního prostředí, 2012. - č. 75 . - S. 55-62 . Archivováno z originálu 24. prosince 2011.
35. ↑ S. H. Doak, B. Manshian, G. J. Jenkins, N. Singh. Strategie testování genotoxicity in vitro pro nanomateriály a přizpůsobení současných pokynů OECD . - Výzkum mutací, 2012. - č. 745 . - S. 104-111 . Archivováno z originálu 24. prosince 2011.
36. ↑ Manosij Ghosh, Maumita Bandyopadhyay, Anita Mukherjee. Genotoxicita nanočástic oxidu titaničitého (TiO2) na dvou trofických úrovních: Rostlinné a lidské lymfocyty  // Chemosféra. - Elsevier BV, 2010. - S. 1253-1262 . Archivováno z originálu 24. října 2022.
37. ↑ Mezinárodní program chemické bezpečnosti. environmentální zdravotní kritéria. Nicel . — INCHEM. Archivováno z originálu 21. února 2014.
38. ↑ 1 2 3 Prokhorova et al., 2003 , str. 5.
39. ↑ Prokhorova I.M. Rostlinné testovací systémy pro hodnocení mutagenů / Comp. JIM. Prochorov. - Jaroslavl: YarSU, 1988. - 13 s. Archivováno 2. června 2016 na Wayback Machine
40. ↑ Paola Poli, Annamaria Buschini, Francesco Maria Restivo, Antonella Ficarelli, Francesca Cassoni1, Iliana Ferrero a Carlo Rossi. Aplikace kometového testu při monitorování životního prostředí: Poškození DNA v lidských leukocytech a rostlinných buňkách ve srovnání s bakteriálními a kvasinkovými testy  // Mutageneze. - Oxford University Press: Oxford Journals, 1999. - č. 14(6) . - S. 547-556 .
41. ↑ Ivanov V.B. Buněčný základ růstu rostlin. - Moskva: Nauka, 1974. - S. 231 .
42. ↑ Tarasov V. A. Principy kvantitativního hodnocení genetického rizika chemických polutantů biosféry // Mutageny a karcinogeny v životním prostředí: nové přístupy k hodnocení zdravotních rizik. - Petrohrad, 1998. - S. 92-117 .
43. ↑ S. A. Mammadli, akademik Národní akademie věd Ukrajiny D. M. Grodzinsky. Role typu opylení v projevu radiací indukované nestability genomu u rostlin  // Dopovіdi z Národní akademie věd Ukrajiny. - Národní akademie věd Ukrajiny, 2007. - č. 7 . - S. 165-170 . Archivováno z originálu 2. července 2013.
44. ↑ Romanovsky A., Song D., Prokhorova I. Mutagenní účinek mobilního telefonu // seznam publikací . Získáno 13. prosince 2010. Archivováno z originálu 3. června 2016. (neurčitý)
45. ↑ 1 2 Song D.S., Romanovsky A.V., Prokhorova I.M. Vývoj metodiky pro hodnocení dopadu UHF záření z mobilních telefonů a dalších zařízení s EMR na organismy in vivo  // Jaroslavl Pedagogical Bulletin . - Jaroslavl: YaGPU im. K.D. Ushinsky, 2010. - V. 3 (Přírodní vědy) , č. 3 . - S. 80-84 . Archivováno z originálu 13. září 2020.
46. ↑ Píseň a další, 2011 , str. 34-45.
47. ↑ Mirta Tkalec, Krešimir Malarić, Mirjana Pavlica, Branka Pevalek-Kozlina a Željka Vidaković-Cifrek. Účinky radiofrekvenčních elektromagnetických polí na klíčení semen a kořenové meristematické buňky Allium cepa L // Výzkum mutací. - Elsevier BV, 2009. - Č. 642(2) . - S. 76-81 .
48. ↑ Olorunfemi D., Iogieseri UM, Akinboro A. Screening genotoxicity průmyslových odpadních vod pomocí cibulek ( Allium cepa L.)  // Appl. sci. Životní prostředí.. - JASEM, 2011. - S. 211-216 . Archivováno z originálu 4. března 2016.
49. ↑ de Rainho ČR, Kaezer A, Aiub CA, Felzenszwalb I. Schopnost kořenových špiček Allium cepa L. a Tradescantia pallida var. purpurea u N-nitrosodiethylaminu hodnocení genotoxicity a mutagenity  // An. Acad. Bras. Cienc.. - 2010. - S. 925-932 . Archivováno z originálu 9. července 2013.
50. ↑ K. Klancnik, D. Drobne, J. Valant, J. Dolenc Koc. Použití modifikovaného testu Allium s nanoTiO2  // Ekotoxikologie a bezpečnost životního prostředí. — Elsevier BV, 2010.  (odkaz není k dispozici)
51. ↑ K. Babu, M. Deepa, S. G. Shankar & S. Rai. Vliv nano-stříbra na buněčné dělení a mitotické chromozomy: Prefatory Siren  // The Internet Journal of Nanotechnology. - ISPUB, 2008. Archivováno z originálu 24. října 2022.
52. ↑ Aganović-Musinović I, Todić M, Becić F, Kusturica J. Hodnocení genotoxicity paracetamolu pomocí Allium testu  // Medical Arh.. - 2004. - No. 58(4) . - S. 206-209 ?? . Archivováno z originálu 20. května 2016.
53. ↑ Aşkin Celik T., Aslantürk OS Hodnocení cytotoxicity a genotoxicity extraktů listů Inula viscosa testem Allium  // J. Biomed. Biotechnol.. - 2010. Archivováno z originálu 23. ledna 2022.
54. ↑ G. GIACOMELLO, P. MALATESTA & G. QUAGLIA. Působení thalidomidu na radikální meristémy Allium cepa  (anglicky)  // Nature. - London: Nature Publishing Group, 1964. - No. 201 . - S. 940-941 . Archivováno z originálu 3. května 2009.
55. ↑ LEOPOLD REJNIAK & HALINA PIOTROWSKA. Vliv malachitové zeleně, konžské červeně a safraninu na buněčné dělení u Gemmae of Allium cepa   // Nature . - London: Nature Publishing Group, 1966. - No. 209 . - str. 517-518 .
56. ↑ Sandra Radić, Draženka Stipaničev, Valerija Vujčić, Marija Marijanović Rajčić, Siniša Širac, Branka Pevalek-Kozlina. Hodnocení genotoxicity povrchových a odpadních vod pomocí testu Allium cepa  // Science of the Total Environment. - Elsevier BV, 2009. - Č. 408 . - S. 1228-1233 . Archivováno z originálu 24. listopadu 2012.
57. ↑ Reginaldo Geremias, Tiago Bortolotto, Danilo Wilhelm-Filho, Rozangela Curi Pedrosa, Valfredo Tadeu de Fávere. Hodnocení účinnosti kyselé drenážní úpravy odpadů z těžby uhlí s použitím Allium cepa L. jako bioindikátoru . - Ekotoxikologie a bezpečnost životního prostředí, 2012. - č. 79 . - S. 116-121 . Archivováno z originálu 24. září 2015.
58. ↑ D. Lerda, M. Biagi Bistoni, P. Pelliccioni & N. Litterio. Allium cepa jako biomonitor toxicity a genotoxicity ochratoxinu A  // Biologie rostlin. - 2010. - č. 58(4) . Archivováno z originálu 7. května 2016.
59. ↑ W.M. Howell, G.E. Keller III, J.D. Kirkpatrick, R.L. Jenkins, R.N. Hunsinger a E.W. McLaughlin. Účinky rostlinného steroidního hormonu, 24-epibrassinolidu, na mitotický index a růst kořenových špiček cibule (Allium cepa)  // Genet. Mol. Res.. - Samford University: GMR, 2007. - č. 6(1) . - S. 50-58 . Archivováno z originálu 28. března 2014.
60. ↑ M. ANNUNCIATA McMANUS. Určité mitotické účinky kinetinu, kyseliny giberelové, kyseliny indoloctové a maleinhydrazidu na kořen Allium cepa   // Příroda . - London: Nature Publishing Group, 1960. - No. 185 . - str. 44-45 .
61. ↑ Haywood Dail Laughinghouse IV, Daniel Prá, Maria Estela Silva-Stenico, Alexandre Rieger, Viviane Dal-Souto Frescura, Marli Fátima Fiore, Solange Bosio Tedesco. Biomonitoring genotoxicity a cytotoxicity Microcystis aeruginosa (Chroococcales, Cyanobacteria) pomocí Allium cepa testu . - Science of The Total Environment, 2012. - č. 432 . - S. 180-188 . Archivováno z originálu 24. září 2015.
62. ↑ 1 2 Prokhorova et al., 2003 , str. 12.
63. ↑ 1 2 Prokhorova et al., 2003 , str. 14-15.
64. ↑ Prokhorova et al., 2003 , str. 17.
65. ↑ Prokhorova et al., 2003 , str. 13.
66. ↑ Prokhorova et al., 2003 , str. čtrnáct.
67. ↑ Song D.S., Romanovsky A.V. Mitóza v rostlinné buňce: norma a patologie  : Vědecký a praktický průvodce. - Moskva: JRE - IRE je. V.A. Kotelnikov RAS, 2010. - S. 929 . Archivováno z originálu 11. února 2012.
68. ↑ 1 2 Prokhorova et al., 2003 , str. 21.
69. ↑ Prokhorova et al., 2003 , str. 15-21.
70. ↑ Romanovsky A.V., Song D.S.,. Efektivní využití tabulkových procesorů na příkladu genotoxikologických studií vzorků vody // Biologie vnitřních vod: Sborník příspěvků z XIV International School-Conference for Young Scientists. - Boroku, IBVV je. I.D. Papanina RAS: Printhouse, 2010. - S. 120-127 .

Literatura

• Song D.S., Romanovsky A.V., Prokhorova I.M., Artyomova T.K., Kovaleva M.I., Fomicheva A.N., Sokolov S.A., Kondakova E.S., Sheshina K.A., Vakorin S.A. Studium biologického účinku modulovaného UHF záření na rostlinné a živočišné organismy in vivo // Biomedicínské technologie a radioelektronika: článek. - Moskva: Radiotechnika, 2011. - č. 4 .
• JIM. Prochorová, M.I. Kovaleva, A.N. Fomichev. Hodnocení mitotoxických a mutagenních účinků faktorů prostředí . — Metodické pokyny. - Jaroslavl: Jaroslavl. Stát un-t. , 2003. - 32 s. - 100 kopií.
• Fiskesjo, Geirid. Biotest s cibulí  = protokol č. 8. Allium test . - Švédsko: Lund University Institute of Genetics, září 1989. Archivováno z originálu 24. října 2022. (Ruština)
• Fiskesjo, Geirid. Allium screeningový test  = Fiskesjo G., The Allium test jako standard v monitorování životního prostředí, Hereditas., V. 102, 1985, str. 99-112. - Švédsko: Ústav genetiky, Univerzita v Lundu, září 1989. (Ruština)

Modelové organismy v biologickém výzkumu

Bakteriofág λ coli Escherichia coli chlamydomonas Chlamydomonas reinhardtii tetrachymen Tetrahymena thermophila pučící kvasinky Saccharomyces cerevisiae štěpné kvasinky Schizosaccharomyces pombe neurospora Neurospora crassa kukuřice Zea mays cibule Allium cepa vojtěška Medicago truncatula fazole Vicia faba resukhovidka Arabidopsis thaliana háďátko Caenorhabditis elegans ovocný let Drosophila melanogaster zebřička Danio Rerio drápatá žába Xenopus laevis šedá krysa Rattus norvegicus domácí myš Mus sval fretka / fretka Mustela furo