Anatelofázová metoda pro analýzu chromozomových aberací

Antelofázní analýza  je genetický test založený na vizuální registraci chromozomálních aberací (chromozomálních poškození) v anafázi a telofázi mitotického buněčného cyklu . Anatelofázová analýza je jednoduchá, ekonomická metoda, která nevyžaduje znalost karyotypu a identifikaci chromozomů. Umožňuje identifikovat pouze určité typy chromozomálních aberací , ale jeho citlivost je zcela dostatečná k závěru o " mutagenním " nebo " nemutagenním " faktoru. Anatelofázová analýza je poměrně citlivá, správná a vhodná v první fázi ekotoxikogenetického výzkumu [1] .

Historie

Úniky genotoxických látek do životního prostředí v důsledku lidské činnosti vyžadují vhodné genetické testy k posouzení potenciálního dopadu těchto faktorů na ekosystémy. Anatelofázová analýza byla popsána jako rychlý a ekonomický genetický test. Mezi nejstarší studie, ve kterých byla tato analýza aplikována, je třeba uvést experimenty na cibuli ( A. Levan ). Doposud byla používána jako hlavní metoda genetické analýzy pro testovací systém Allium test rostlin , který studuje účinek různých genotoxických látek na buňky kořenového meristému [2] [3] [4] .

Citlivost a použitelnost

Anatelofázová analýza je vysoce citlivá pro testy velmi odlišných směrů. Ať už se jedná o vzorky substrátů z prostředí ( voda , půda , dnové sedimenty ) nebo látky antropogenního původu, ale i záření různých spekter (ionizujících i neionizujících). Výhodou této analýzy je navíc její univerzálnost (je použitelná téměř ve všech případech mitózy ) a snadná příprava preparátů, což je velmi důležité při práci s živočišnými buňkami [5] . Antelofázová analýza chromozomových aberací v buňkách cibule ( Allium cepa ) se doporučuje jako nástroj pro environmentální cytomonitoring. Měřením genotoxicity přispívá k hodnocení míry environmentálního rizika z výrobků pro domácnost a průmysl, které jsou neustále zaváděny a nabývají na významu v každodenním životě [2] [6] .

Technika analýzy

Zahrnuje analýzu preparátu buněk fixovaných a obarvených ve fázi proliferace pod mikroskopem . Existuje řada variant antelofázové analýzy. Podle původní verze analýzy popsané Fiskesjo ( 1985 ) se tedy na preparátu počítá prvních 100 buněk anafáze a telofáze , z nichž jsou zaznamenány aberantní buňky . Později se začala používat jiná verze I. M. Prokhorova a spol. (2003), který bere v úvahu všechny anafáze a telofáze na preparátu, mezi nimiž jsou zaznamenány aberantní . Nepříliš časné anafáze a časné telofáze jsou vhodné pro vysvětlení chromozomálních aberací . Protože se dělící buňka ne vždy šíří na preparátu podél podélné osy dělení, při výběru buněk vhodných pro počítání chromozomových aberací je třeba vzít v úvahu vzdálenost mezi dceřinými jádry  - nesmí být menší než velikost jednoho z je [1] [2] [6 ] .

Typy analyzovaných aberací

Ve stádiu anafáze a telofáze jsou vypočteny dvě kategorie aberací, klasické pro tuto analýzu, kterými jsou chromozomální materiál zaostávající za póly (acentrické fragmenty a prstence, zaostávající chromozomy) a můstky. Všechny jsou zcela jasně viditelné vizuálně a rozlišitelné. Velmi často jsou zpoždění a překročení indikující změny v achromatinovém vřeténku zahrnuty a započítány do samostatné kategorie.

1. Acentrické fragmenty a prstence mohou být jednoduché nebo párové. Jsou umístěny mezi dětskými hvězdami nebo daleko od nich. Hlavním úkolem je rozpoznat jednotlivost nebo párování a odlišit je od zaostávajících chromozomů. Jednotlivé fragmenty jsou fragmenty chromatidového původu. Ztráta jednoho fragmentu z páru (chromozomálního původu) je zjevně vzácný jev, protože přitažlivost mezi sesterskými chromatidami je zachována i ve stádiu anafáze. Ze stejného důvodu je nepravděpodobné, že by v důsledku fúze sesterských chromatid párového fragmentu a jejich rozvinutí po délce mohl vzniknout jediný fragment.
2. Párové fragmenty jsou fragmenty isochromatidového nebo chromozomálního původu. O spojení poškozených konců sesterských chromatid, nikoli o zaostávajícím chromozomu, můžeme mluvit pouze tehdy, má-li párový fragment obloukovitý vzhled. Je třeba poznamenat, že posouzení tohoto znaku je extrémně obtížné, a proto jej nelze provést ve všech případech.
3. Můstky se někdy dělí na chromozomální a chromatidové. Chromozomový můstek je chápán jako dicentrický chromozom: skládá se ze dvou chromatid, nejčastěji zkřížených. Chromatidový můstek je dicentrická chromatid, takže je viděn jako jediná chromatid. Podle "tloušťky" můstku nelze posoudit jeho chromozomální nebo chromatidový charakter. Ne vždy je možné odlišit povahu můstku, a proto je stěží vhodné provádět takovou separaci metodou barvení totálních chromozomů, která neumožňuje identifikaci jednotlivých chromatid.
4. Lagging chromozomy nebo chromatidy jsou nejčastěji snadno rozpoznatelné, protože mohou být viděny jako centromera nebo strukturní heterogenita, která není typická pro fragmenty. Největší potíže nastávají, když je nutné odlišit opožděnou metacentrickou chromatidu od akrocentrického chromozomu. Přitom odpověď na tuto otázku je důležitá, protože následkem zaostávání za chromozomem vznikají dvě hypoploidní buňky a zaostáváním za chromatidou jedna hypoploidní a jedna normální buňka.

Nemůže existovat žádný absolutní standard pro zohlednění aberací a pro prezentaci získaných výsledků. V praxi dochází ke kombinacím různých typů aberací ve stejné buňce. Teoreticky lze očekávat jakoukoliv kombinaci aberací. Základem je asynchronnost reduplikace dědičného materiálu. Kromě toho lze po cestě zaznamenat i další, méně obvyklé typy aberací, jako jsou multipolární mitózy a polyploidie [6] .

Výpočet rychlosti mutace

Označení	Charakteristický	Výpočet
XA+abs.	XA+abs., %  — četnost chromozomálních aberací a lagů Frekvence chromozomových aberací a lagů  se vypočítá jako poměr součtu ana- a telofázových buněk, ve kterých bylo zaznamenáno porušení, k celkovému počtu analyzovaných ana-telefází.	, kde XA+ots.  je součet aberantních buněk ve stadiu ana- a telofáze a N(A+T)  je celkový počet analyzovaných anafází a telofází na preparátu.

Transformace

Frekvenci chromozomálních aberací a lagů lze vyjádřit jako závažnost mutagenního účinku podle systému integrálního hodnocení mutagenního účinku.

Doporučení pro provádění antelofázové analýzy

Pro většinu studií lze doporučit následující:

1. Důležitou podmínkou při posuzování typů (spektrum a frekvence chromozomových aberací) je jejich zohlednění při prvním buněčném dělení po působení mutagenu. Je to dáno tím, že značná část aberací a aberantních buněk je po prvním dělení eliminována nebo získává jinou formu, i když některé chromozomové aberace, které jsou pozorovány ve formě můstků, mohou přetrvávat 12-15 mitotických cyklů.
2. Neanalyzujte přeuspořádání, když jsou buňky superponovány a když je narušena integrita jejich membrány.
3. Vezměte v úvahu všechny typy morfologických změn, které lze touto technikou zohlednit.
4. Analyzujte změny buňku po buňce, to znamená zapište do protokolu experimentů kompatibilitu aberací vyskytujících se v každé buňce.
5. Buňky, u kterých není možné určit typ aberací, by měly být zařazeny do třídy buněk s netříděnými aberacemi; počítat je pouze při výpočtu celkového počtu aberantních buněk.
6. Při kombinování dat jakéhokoli druhu buďte extrémně opatrní (například data z jednotlivých replikátů a data z podobných experimentů, z tečkovaných fragmentů a prstenců, z dicentrických a doprovodných acentrik atd.). Pokud je pro nějaký objekt nebo podmínky prokázána platnost nějaké asociace, pak pro jiné objekty a podmínky musí být speciálně zkontrolována.
7. Při prezentaci dat v článku je nutné uvést počet vyšetřených jedinců (nebo opakování experimentu), počet analyzovaných buněk, počet jednotlivých typů zohledňovaných aberací, typy aberantních buněk a jejich frekvence a počet aneuploidních buněk.

Pro přesné určení je nutné znát strukturu karyotypu studovaného rostlinného nebo živočišného druhu v normě [6] .

Metody a objekty založené na této metodě

• Allium test
• Vicia test

Viz také

• Metafázová analýza
  • Allium test
• Mitotický index
• Chromozomální přestavby

Poznámky

1. ↑ 1 2 Prokhorova I. M., Fomicheva P. N., Kovaleva M. I. Hodnocení mitotoxických a mutagenních účinků faktorů prostředí // YarSU: Guidelines. - Jaroslavl: YarGU, 2003. - S. 23.26 .
2. ↑ 1 2 3 Jet Rank. Metoda testu Allium anafáze-telofáze chromozomové aberace // Ekologija. - Vilnius, 2003. - T. 1 . - S. 38-42 .
3. ↑ Levan Albert. VLIV KOLCHICINU NA KOŘENOVÉ MITÓZY V ALLIUM // Hereditas. - 1938. - T. 24 , čís. 4 . — S. 471-486 .
4. ↑ Fiskesjo G. The Allium Test jako standard v monitorování životního prostředí  // Hereditas. - 1985. - T. 102 . - S. 99-112 .
5. ↑ W. Venegas, C. Lasne, R. Lowy, J.-P. Buisson a I. Chouroulinkov. Naftofurany indukované chromozomální aberace detekované v metafázi, anafázi a telofázi V79 buňkách čínského křečka // Mutation Research/Genetic Toxicology. - Elsevier BV, 1985. - S. 53-62 .
6. ↑ 1 2 3 4 Kalaev V.N., Karpova S.S. Cytogenetický monitoring: metody hodnocení znečištění životního prostředí a stavu genetického aparátu organismu. - VSU, 2004. - 80 s.

Odkazy

• Song D.S., Romanovsky A.V. Mitóza v rostlinné buňce: norma a patologie  : Vědecký a praktický průvodce. - Moskva: JRE - IRE je. V.A. Kotelnikov RAS, 2010. - S. 929 .