Fluorescenční hybridizace in situ

Fluorescenční in situ hybridizace neboli FISH metoda ( fluorescenční in situ hybridizace - FISH ) je cytogenetická  metoda , která se používá k detekci a určení polohy specifické sekvence DNA na metafázových chromozomech nebo v interfázových jádrech in situ . Kromě toho se FISH používá k detekci specifických mRNA ve vzorku tkáně . V druhém případě metoda FISH umožňuje stanovit časoprostorové rysy genové exprese v buňkách a tkáních.

Metoda FISH se využívá v preimplantační , prenatální a postnatální genetické diagnostice [1] , v diagnostice onkologických onemocnění [2] , v retrospektivní biologické dozimetrii [3] .

Sondy

Fluorescenční in situ hybridizace využívá DNA sondy (DNA sondy), které se vážou na komplementární cíle ve vzorku. DNA sondy obsahují nukleosidy značené fluorofory (přímé značení) nebo konjugáty, jako je biotin nebo digoxigenin (nepřímé značení). S přímým značením lze DNA sondu navázanou na cíl pozorovat fluorescenčním mikroskopem ihned po dokončení hybridizace . V případě nepřímého značení je nutný další postup barvení, během kterého je biotin detekován pomocí fluorescenčně značeného avidinu nebo streptavidinu a digoxigeninu pomocí fluorescenčně značených protilátek . Přestože nepřímá varianta značení DNA sondy vyžaduje další reagencie a časové náklady, tato metoda obvykle umožňuje dosáhnout vyšší úrovně signálu díky přítomnosti 3–4 molekul fluorochromu na protilátce nebo molekule avidinu. V případě nepřímého značení je navíc možné kaskádové zesílení signálu [4] .

K vytvoření DNA sond se používají klonované sekvence DNA (například Noi I-vazebné klony 3. lidského chromozomu , BAC klony) [5] [6] , genomová DNA, produkty PCR , značené oligonukleotidy a také DNA, získaná mikrodisekcí [4] .

Značení sondy může být provedeno různými způsoby, například nick-translací nebo PCR se značenými nukleotidy .

Hybridizační postup

Prvním krokem je návrh sond. Velikost sondy by měla být dostatečně velká, aby hybridizace probíhala ve specifickém místě, ale ne příliš velká (ne více než 1 kb), aby neinterferovala s hybridizačním procesem. Při identifikaci specifických lokusů nebo při barvení celých chromozomů je nutné blokovat hybridizaci DNA sond s nejedinečnými repetitivními sekvencemi DNA přidáním neznačených repetic DNA (např. Cot-1 DNA ) do hybridizační směsi. Pokud je DNA sondou dvouřetězcová DNA, musí být před hybridizací denaturována.

V další fázi se připravují interfázová jádra nebo metafázové chromozomy. Buňky jsou fixovány na substrát, obvykle podložní sklíčko, s následnou denaturací DNA . Pro zachování morfologie chromozomů nebo jader se denaturace provádí v přítomnosti formamidu , což umožňuje snížit teplotu denaturace na 70 °C.

Dále se k přípravku přidají sondy a hybridizace se provádí po dobu přibližně 12 hodin. Poté proveďte několik fází promývání, abyste odstranili všechny nehybridizované sondy.

Vizualizace navázaných DNA sond se provádí pomocí fluorescenčního mikroskopu. Intenzita fluorescenčního signálu závisí na mnoha faktorech — účinnosti značení sondy, typu sondy a typu fluorescenčního barviva.

Viz také

RGEN-ISL Molekulární zobrazovací metoda využívající RNA-řízenou endonukleázu CRISPR/dCas9 spojenou se značkou. Na rozdíl od klasické fluorescenční in situ hybridizace RGEN-ISL nevyžaduje denaturaci DNA, a proto poskytuje lepší zachování struktury chromatinu.

Poznámky

1. ↑ Shilova N. V., Zolotukhina T. V. Interfázová fluorescenční hybridizace in situ v diagnostice numerických chromozomových aberací // Lékařská genetika. - 2007. - T. 6. - č. 10. - S. 53-58.
2. ↑ Most JA, Cushman-Vokoun AM . Molekulární diagnostika nádorů měkkých tkání  (neopr.)  // Archives of Pathology & Laboratory Medicine . - 2011. - Květen ( roč. 135 , č. 5 ). - S. 588-601 . - doi : 10.1043/2010-0594-RAIR.1 . — PMID 21526957 .
3. ↑ Ainsbury EA, Bakhanova E., Barquinero JF et al. Přehled retrospektivních dozimetrických technik pro externí expozice ionizujícímu záření  // Radiation Protection Dosimetry  : journal  . - 2011. - Listopad ( roč. 147 , č. 4 ). - str. 573-592 . doi : 10.1093 / rpd/ncq499 . — PMID 21183550 . Archivováno z originálu 20. listopadu 2015.
4. ↑ 1 2 Rubtsov N. B. Metody práce se savčími chromozomy: Proc. příspěvek . - Novosibirsk : Novosib. Stát un-t , 2006. - 152 s. — ISBN 5-94356-376-8 . Archivováno 2. dubna 2015 na Wayback Machine
5. ↑ Sazanov AA, Sazanova AL, Stekol'nikova VA, Kozyreva AA, Romanov MN, Malewski T., Smirnov AF Chromozomální lokalizace sedmi HSA3q13→q23 NotI spojujících klony na kuřecích mikrochromozomech: ortologie GGA14 a GGA15 oblasti bohaté na geny HSA3  (anglicky)  // Cytogenetic and Genome Research : časopis. - Basilej , Švýcarsko : Karger Publishers , 2005. - Sv. 111, č.p. 2 . - S. 128-133. — ISSN 1424-8581 . - doi : 10.1159/000086381 . — PMID 16103653 . Archivováno z originálu 15. března 2015.  (Přístup: 15. března 2015)
6. ↑ Sazanov AA, Romanov MN, Sazanova AL, Korczak M., Stekol'nikova VA, Kozyreva AA, Smirnov AF, Jaszczak K., Dodgson JB Chromozomální lokalizace 15 velkých inzertních klonů BAC obsahujících tři mikrosatelity na kuřecím chromozomu 4 (GGA4) zpřesnit polohu centromery  // Genetika zvířat  : časopis  . - Oxford , Velká Británie : International Society for Animal Genetics; Blackwell Publishers Ltd , 2005. Vol. 36, č. 2 . - S. 161-163. — ISSN 0268-9146 . - doi : 10.1111/j.1365-2052.2004.01225.x . — PMID 15771730 . Archivováno z originálu 2. dubna 2015.  (Přístup: 15. března 2015)

Literatura

• Rubtsov N.B. In situ hybridizace nukleových kyselin při analýze chromozomálních abnormalit // Molekulárně genetické metody v diagnostice dědičných a onkologických onemocnění. Úvod do molekulární diagnostiky / Ed. M. A. Palceva, D. V. Zaletaeva. - M .: Medicína , 2011. - T. 2. - S. 100-136. - 1000 výtisků.  - ISBN 978-5-225-03557-0 .

Slovníky a encyklopedie	velká čínština velká čínština Britannica (online)