DNA hybridizace

DNA hybridizace , hybridizace nukleových kyselin - in vitro kombinace komplementárních jednovláknových nukleových kyselin do jedné molekuly. Při úplné komplementaritě je kombinace snadná a rychlá a v případě částečné nekomplementarity se zpomaluje slučování řetězců, což umožňuje posoudit míru komplementarity. Je možná hybridizace DNA-DNA a DNA-RNA.

Protokol experimentu

Dvouřetězcová DNA se zahřeje ve vhodném pufru . Vlivem změn vnějších podmínek se vodíkové vazby mezi komplementárními dusíkatými bázemi stávají termodynamicky nepříznivými a řetězce se rozcházejí.
Preparát denaturované DNA se smíchá s jinou denaturovanou DNA.
Preparáty se pomalu chladí, přičemž jednovláknová DNA mezi sebou hybridizuje (vznikají vodíkové vazby mezi komplementárními bázemi), přičemž vzniká „hybridní“ molekula DNA.

Analýza rychlosti nasedání (=hybridizace) jednořetězcové DNA umožňuje vyhodnotit podobnosti a rozdíly v sekvencích DNA mezi druhy nebo jedinci stejného druhu.

Výpočet bodu tání DNA

Sekundární struktura DNA hraje důležitou roli v biologii, genetické diagnostice a dalších metodách molekulární biologie a nanotechnologií. Přesné stanovení teploty tání molekul DNA nebo RNA proto hraje velmi důležitou roli ve všech molekulárně biologických metodách, například při výběru vzorků nebo oligonukleotidů pro mikročipy nebo při výběru primerů pro PCR . Existuje několik jednoduchých vzorců pro výpočet bodu tání pro krátké oligonukleotidy. Hrubý výpočet teploty tání (T m ) krátkého oligonukleotidu (<20 nukleotidů ) se provádí přímým počítáním počtu nukleotidů (G + C je součet všech guaninů a cytosinů , L je délka oligonukleotid):

$T_{m}=2(L+G+C)$ , [1]

Průměrný vzorec pro výpočet Tm pro krátký oligonukleotid (a pro dlouhé fragmenty DNA) s přihlédnutím ke koncentraci K + iontů a DMSO :

$T_{m}=77,1+11,7\lg[K^{+}]+{\frac {41(G+C)-528}{L))-0,75[\%DMSO]$ , [2]

Tyto rovnice však neberou v úvahu iniciaci vazby během oligonukleotidové hybridizace, neberou v úvahu rysy samotné sekvence a konečný efekt charakteristický pro oligonukleotidové duplexy. Proto je tento vzorec vhodnější tam, kde je sekvence DNA zprůměrována a délka duplexů je přes 40 nukleotidů.

Termodynamika DNA

Nejběžnější metoda, která se dnes používá k výpočtu teploty tání dvouvláknové nebo jednovláknové DNA, je založena na dvoukrokovém termodynamickém modelu. Dvě komplementární molekuly DNA A a B jsou buď vzájemně vázány, nebo jsou volné v roztoku (“random coil state”). Obvykle se předpokládá, že molekuly A a B jsou zcela komplementární, takže jejich hybridizace je zřejmá a je povolena jedna nebo více chyb komplementarity v duplexu, včetně nekomplementárních párů GG, GT a GA ( wobble pairs ). V případě pouze jedné molekuly se předpokládá, že je zabalena do smyčkové struktury. Proces hybridizace na duplex je popsán vzorcem:

$A+B\longleftrightarrow AB$

kde A a B jsou různé řetězce v roztoku („stav náhodné cívky“) a AB je vytvořený duplex. Tato reakce je reverzibilní. Rovnovážná konstanta kpro tuto reakci je definována jako: . $k={\frac {[AB]}{[A][B]}}$

Rovnovážná konstanta závisí na koncentraci řetězce, teplotě, koncentraci soli, pH a dalších složkách v reakci (např . glycerol nebo DMSO ). Konstanta k se mění v reakci na změnu koncentrace jednoho nebo obou řetězců ([At] a/nebo [Bt]), na změny pak reaguje celý systém a následně jednotlivé koncentrace [A], [B] a [AB] se také změní. Například, pokud je v systému více řetězce A, pak se koncentrace [AB] zvýší. Předpokládejme, že rovnovážná konstanta je 1,81×10 6 a koncentrace řetězců je [At] = [Bt] = 10 −5 M:

$k=1,81\cdot 10^{6}={\frac {[AB]}{[A][B]}}$

$[At]=10^{-5}M=[A]+[AB]$

$[Bt]=10^{-5}M=[B]+[AB]$

Pro výpočet dosadíme složky ve vzorcích k:

$k={\frac {[AB]}{([A]-[AB])([Bt]-[AB]))))$

$k=1,81\cdot 10^{6}={\frac {[AB]}{[A][B]}}$

$1.81\cdot 10^{6}={\frac {[AB]}{(10^{-5}-[AB])(10^{-5}-[AB])))$

Po přeskupení dostaneme:

$O=k[AB]^{2}-{\frac {k[At]+k[Bt]+1}{[AB]+k[At][Bt]}}$

$O=aX^{2}+bX+c$

kde . $[AB]=X={\frac {\pm b{\sqrt {(}}b^{2}-4ac)}{2a}}$

Například, když se do tohoto vzorce dosadí [AB] = 7,91x10 −6 M, koncentrace řetězců bude [A] = [B] = 2,09x10 −6 M. To znamená, že pouze 79 % řetězců [At ] bude připojen v duplexu [AB ].

Je možné určit rovnovážné konstanty se změnou teploty? To nás přivádí k pochopení důležitých termodynamických parametrů, jako je volná energie (dG), entalpie (dH) a entropie (dS). Ke změnám volné energie, entalpie a entropie dochází při přechodu z „hybridizační teploty T“ do neuspořádaného, náhodného stavu. Tyto vztahy jsou definovány vzorcem dG = dH – TdS, (pro koncentraci řetězce [A] = [B] = [AB] = 1M), pak ideální vzorec pro výpočet Gibbsovy volné energie je:

$dG_{T}^{0}={\frac {dH^{0}-TdS^{0}}{1000}}$

kde Tteplota je v Kelvinech, dH° (cal/mol) a dS° (cal/mol K).

Existuje užitečný vztah týkající se změny Gibbsovy volné energie během chemické reakce k její rovnovážné konstantě:

$dG_{T}^{0}=-RT\cdot \ln(k)$

kde R je univerzální plynová konstanta (1,987 cal/mol K).

Spojením obou vzorců dostaneme:

$T={\frac {dH^{0}}{dS^{0}-R\ln(k)))$

Teplota tání (T m ) se určuje v rovnováze, kdy je polovina řetězců navzájem spojena a druhá polovina je ve volném stavu, tedy k=1:

$T={\frac {dH^{0}}{dS^{0}}}-273,15$

Teplota tání pro jednoduchou smyčku se vypočítá jako . U duplexu DNA je nutné vzít v úvahu koncentraci každého vlákna (v molech, M). Pokud jsou tedy [A] a [B] koncentrace molekul A a B, pak se celková koncentrace řetězců C rovná jejich součtu [A] + [B]. $T_{m}(K)={\frac {dH^{0}}{dS^{0}}}$

Předpokládá se, že koncentrace obou řetězců je stejná [A] = [B] = C/2. V tomto případě

$T_{m}(K)={\frac {dH^{0}}{dS^{0}+R\cdot \ln({\frac {C}{f}})))$

kde f = 4. Pro autokomplementární oligonukleotid [A 0 ] = C a pak f = 1. Tato teplota tání je určena pouze tehdy, když je polovina molekul navázána na sebe.

Pro samokomplementární oligonukleotid k = 1/[At] tedy:

$T_{m}={\frac {dH^{0}}{dS^{0}+R\ln([At])))-273,15$

Pro nekomplementární duplex, když [At] ≥ [Bt], k = 1/([At] - [Bt]/2), se Tm vypočítá následovně:

$T_{m}={\frac {dH^{0}}{dS^{0}+R\ln([At]-{\frac {[Bt]}{2))))}-273,15$

kde [At] je molární koncentrace dominantního řetězce (obvykle primeru PCR) a [Bt] je molární koncentrace vlákna s nízkou koncentrací (genomové DNA).

Výpočet bodu tání

Přírůstky ΔG, ΔH a ΔS termodynamických parametrů G, H a S jsou vypočteny na základě modelu nejbližšího souseda. Přesná predikce sekundární struktury DNA během hybridizace pomocí algoritmů dynamického programování vyžaduje databázi všech možných termodynamických parametrů pro každý komplementární pár bází, stejně jako pro všechny varianty v nukleotidových neshodách, pro volné konce, vlásenky a smyčky. Termodynamický vzorec pro výpočet krátkého oligonukleotidu je založen na termodynamických parametrech - entropii S a entalpii H, pro každou z 10 kombinací čtyř nukleotidů (tabulka 1). Tabulka 1 ukazuje termodynamické parametry pro nejbližší sousedy (NN) pro nukleotidové páry při koncentraci 1M NaCl.

Pro výpočet Tm (°С) se všechny Gibbsovy hodnoty volné energie pro každý pár sečtou v přírůstcích jednoho nukleotidu:

ΔG celkem = ΔG počáteční + ΔG symetrie + ∑ΔG + ΔG AT konec

5'-CGTTGA-3'	= ΔG počáteční + ΔG symetrie +	CG+GT+TT+TG+GA+AT konec
3'-GCAACT-5'		GC CA AA AC CT

ΔG teoretické = 1,96 + 0 - 2,17 - 1,44 - 1,44 - 1,00 - 1,45 - 1,30 + 0,05

AG teoretický = -5,35 kcal/mol

Přírůstky entropie (ΔH = -43,5 kcal/mol) a entalpie (ΔS = -122,5) se vypočítají podobně:

$T_{m}={\frac {-43.5\cdot 1000}{-122.5+1.9872\ln({\frac {0.0004}{4))))}-273.15=35.8$

Mnoho duplexů DNA má konkurenční jednovláknové struktury. Tím se posouvá rovnováha systému a v důsledku toho je hodnota T m nižší než hodnota předpovězená vzorcem.

Obecný vzorec pro výpočet Tm s korekcí na sůl v roztoku je:

$T_{m}={\frac {\Delta H\cdot 1000}{dS+R\ln({\frac {C}{4))))+0,386(L-1)\ln([K^ {+}])}}-273,15$

kde L je délka oligonukleotidu, R je plynová konstanta (1,987 cal/K mol), c je koncentrace oligonukleotidu v (obvykle 2x10 −7 M), [K + ] je koncentrace draselných iontů v molech (obvykle 5x10 -2 M).

Tabulka 1. Termodynamické parametry pro nejbližší sousedy (NN) pro nukleotidové páry při koncentraci 1M NaCl [3] , [4]

Posloupnost párů (5'-3'/3'-5')	$\Delta H$ ° kcal/mol	$\Delta S$ ° cal/(mol K)	$\Delta G$ ° 37 kcal/mol
AA/TT	-7.6	-21.3	-1,00
AT/TA	-7.2	-20.4	-0,88
TA/AT	-7.2	-20.3	-0,58
CA/GT	-8.5	-22.7	-1,45
GT/CA	-8.4	-22.4	-1,44
CT/GA	-7.8	-21.0	-1,28
GA/CT	-8.2	-22.2	-1,30
CG/GC	-10.6	-27.2	-2.17
GC/CG	-9.8	-24.4	-2,24
GG/CC	-8,0	-19.9	-1,84
zahájení	+0,2	-5.7	+1,96
koncový pár AT	+2,2	+6,9	+0,05
korekce symetrie	0,0	-1.4	+0,43

Jediná chyba v duplexu

Model nejbližšího souseda pro komplementární nukleotidové páry může být rozšířen na páry, které zahrnují nekomplementární nukleotidy. Ukázalo se, že existuje trend snižovat stabilitu nekomplementárních párů bází v sestupném pořadí:

GC > AT > G G > G T ≥ G A > T T ≥ A A > T C ≥ A C ≥ C C

Guanidin G je nejpromiskuitnější báze, protože tvoří jak nejsilnější páry bází, tak stabilní páry s nekomplementárními bázemi (G·G, G·T a G·A). Na druhé straně je cytosin C nejvíce diskriminační bází, protože tvoří nejstabilnější komplementární páry a nestabilní páry s nekomplementárními bázemi (T·C ≥ A·C ≥ C·C) [5] , [6] .

Viz také

Poznámky

↑ Wallace RB, Shaffer J., Murphy RF, Bonner J., Hirose T., Itakura K. Hybridizace syntetických oligodeoxyribonukleotidů na phi chi 174 DNA: účinek neshody jednoho páru bází // Nucleic Acids Res : deník. - 1979. - Sv. 6 , č. 11 . - S. 3543-3557 . doi : 10.1093 / nar/6.11.3543 .
↑ Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Teploty tání oligonukleotidů za podmínek pcr: korekce nejbližšího souseda pro koncentrace Mg 2+ , deoxynukleotid trifosfátu a dimethylsulfoxidu ve srovnání s alternativními empirickými vzorci // Clinical Chemistry: journal. - 2001. - Sv. 47 , č. 11 . - S. 1956-1961 . Archivováno z originálu 1. září 2012.
↑ SantaLucia JJ, Hicks D. Termodynamika strukturních motivů DNA // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure : journal . - 2004. - Sv. 33 . - doi : 10.1146/annurev.biophys.32.110601.141800 .
↑ SantaLucia JJ Jednotný pohled na termodynamiku nejbližšího souseda polymerní, činkové a oligonukleotidové DNA // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : journal . - 1998. - Sv. 95 , č. 4 . - S. 1460-1465 . - doi : 10.1073/pnas.95.4.1460 . — PMID 9465037 .
↑ Peyret N., Seneviratne PA, Allawi HT, SantaLucia JJ Termodynamika nejbližšího souseda a NMR sekvencí DNA s vnitřními neshodami AA, CC, GG a TT // Biochemistry: journal. - 1999. - Sv. 38 . - str. 3468-3477 . - doi : 10.1021/bi9825091 .
↑ Allawi HT, SantaLucia JJ Termodynamika a NMR vnitřních neshod GT v DNA // Biochemistry : journal. - 1997. - Ne. 36 . - S. 10581-10594 . doi : 10.1021 / bi962590c .