Streptavidin / ˌstrɛpˈtævɪdɪn / je 66,0 kDa ( tetramer ) protein , purifikovaný z bakterie Streptomyces avidinii . _ _ _ _ _ _ Homotetramery streptavidinu mají extrémně vysokou afinitu k biotinu (také známému jako vitamín B 7 nebo vitamín H). S disociační konstantou (K d ) řádově ≈10 -14 mol/l [1] je vazba biotinu na streptavidin jednou z nejsilnějších nekovalentních interakcí známých v přírodě. Streptavidin je široce používán v molekulární biologii a bionanotechnologii kvůli odolnosti komplexu streptavidin-biotin vůči organickým rozpouštědlům, denaturačním činidlům (např. guanidiniumchlorid ), detergentům (např. SDS , Triton X-100 ), proteolytickým enzymům a teplotním a pH extrémům.
Krystalová struktura streptavidinu vázaného na biotin byla popsána dvěma skupinami v roce 1989. Struktura byla řešena pomocí multivlnné anomální difrakce podle Hendricksona et al. [2] na Kolumbijské univerzitě a pomocí mnohonásobné izomorfní substituce od Webera et al. [3] ve společnosti EI DuPont Central Research and Development. K září 2017 bylo v Protein Data Bank uloženo 171 struktur . Úplný seznam naleznete na tomto odkazu . N- a C-konce úplného 159 zbytkového proteinu jsou zpracovány za vzniku kratšího "jádrového" streptavidinu, typicky sestávajícího ze zbytků 13-139; odstranění N- a C-konců je nezbytné pro dosažení nejvyšší vazebné afinity k biotinu. Sekundární struktura streptavidinového monomeru se skládá z osmi antiparalelních β-řetězců, které se skládají za vzniku antiparalelní β-barelové terciární struktury. Biotin vazebné místo je umístěno na jednom konci každého β-barelu. Čtyři identické streptavidinové monomery (tj. čtyři identické p-kmeny) se vážou za vzniku tetramerní kvartérní struktury streptavidinu. Biotin vazebné místo v každém stonku sestává ze zbytků z vnitřku stonku spolu s konzervovaným Trp120 ze sousední podjednotky. Každá podjednotka tedy přispívá k vazebnému místu sousední podjednotky, a proto lze tetramer také považovat za dimer funkčních dimerů.
Četné krystalové struktury komplexu streptavidin-biotin objasnily původ této pozoruhodné afinity. Za prvé, existuje vysoká komplementarita tvaru mezi vazebnou kapsou a biotinem. Za druhé, existuje rozsáhlá síť vodíkových vazeb vytvořených s biotinem na vazebném místě. Existuje osm vodíkových vazeb přímo ke zbytkům na vazebném místě (tzv. „první skořápka“ vodíkových vazeb), včetně zbytků Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 a Asp128. Existuje také „druhý plášť“ vodíkových vazeb, včetně zbytků, které interagují s prvními zbytky pláště. Afinita streptavidinu k biotinu však převyšuje afinitu, kterou by bylo možné předpovědět pouze z interakcí vodíkových můstků, což ukazuje na další mechanismus přispívající k vysoké afinitě [4] . Kapsa vázající biotin je hydrofobní a existují četné van der Waalsem zprostředkované kontakty a hydrofobní interakce s biotinem, když je v kapse, což je také považováno za vysvětlení vysoké afinity. Zejména je kapsa vyložena konzervovanými zbytky tryptofanu. Nakonec je vazba biotinu doprovázena stabilizací flexibilní smyčky spojující β-řetězce 3 a 4 (L3/4), která se uzavře nad navázaným biotinem, působí jako „víčko“ nad vazebnou kapsou a umožňuje extrémně pomalé uvolňování biotin. míra disociace.
Většina pokusů o mutaci streptavidinu vede ke snížení vazebné afinity biotinu, což lze v takovém optimalizovaném systému očekávat. Bylo však zjištěno, že nově vytvořený mutant streptavidinu s názvem traptavidin disociuje biotin více než desetkrát pomaleji, navíc má vyšší tepelnou a mechanickou stabilitu [5] . Tento pokles míry disociace byl doprovázen dvojnásobným poklesem rychlosti asociace.
Biotin-vazebná afinita může být narušena chemickým značením streptavidinu, jako například s amino-reaktivními fluorofory ; Flavidin je mutant streptavidinu bez lysinových postranních řetězců, který si po označení fluorescenčním barvivem zachovává dobré vazebné vlastnosti biotinu, když je barvivo navázáno na amino-konec [6] .
Mezi nejčastější použití streptavidinu patří čištění nebo detekce různých biomolekul. Silné interakce streptavidinu a biotinu lze využít k připojení různých biomolekul k sobě navzájem nebo k pevnému nosiči. K narušení interakce streptavidin-biotin, která často denaturuje čištěný protein zájmu, jsou nezbytné přísné podmínky. Bylo však prokázáno, že krátká inkubace ve vodě nad 70 °C reverzibilně naruší interakci (alespoň u biotinylované DNA) bez denaturace streptavidinu, což umožní opětovné použití pevného nosiče streptavidinu [7] . Další aplikací streptavidinu je čištění a detekce proteinů geneticky modifikovaných peptidem Strep-tag . Streptavidin je široce používán ve Western blottingu a imunotestech konjugovaných s některými reportérovými molekulami, jako je křenová peroxidáza . Streptavidin byl také použit ve vznikající oblasti nanobiotechnologie , pomocí biologických molekul, jako jsou proteiny nebo lipidy, k vytvoření zařízení/struktur v nanoměřítku . V této souvislosti může být streptavidin použit jako stavební blok pro vazbu biotinylovaných molekul DNA k vytvoření lešení z jednostěnných uhlíkových nanotrubic [8] nebo dokonce komplexních polyedrů DNA [9] . Tetramerní streptavidin byl také použit jako centrum, kolem kterého mohou být umístěny další proteiny buď pomocí afinitní značky, jako je Strep-tag nebo AviTag , nebo genetickou fúzí s SpyTag [10] . Fúze s SpyTag umožnila vytvoření sestav s 8 nebo 20 podjednotkami streptavidinu. Spolu se sondou molekulární síly pro studium mikroskopie atomárních sil [11] byly vytvořeny také nové materiály, jako jsou trojrozměrné krystalové mřížky [12] . Streptavidin má slabě kyselý izoelektrický bod (pI) ~5, ale komerčně dostupná je také rekombinantní forma streptavidinu s téměř neutrálním pí.
Předem cílená imunoterapiePředem cílená imunoterapie využívá streptavidin konjugovaný s monoklonální protilátkou proti rakovinotvorným antigenům, po které následuje injekce radioaktivně značeného biotinu k dodání záření pouze do rakovinné buňky. Počáteční překážky zahrnují saturaci biotinových vazebných míst na streptavidinu endogenním biotinem namísto podávaného radioaktivně značeného biotinu a vysoký stupeň radioaktivní expozice ledvin kvůli silným adsorpčním vlastnostem streptavidinu na buňky. Tato vysoká úroveň vazby na typy adherentních buněk, jako jsou aktivované krevní destičky a melanomy, je nyní považována za důsledek vazby integrinu zprostředkované sekvencí RYD ve streptavidinu [13] .
Streptavidin je tetramer a každá podjednotka váže biotin se stejnou afinitou. Multivalence je výhodou v aplikacích, jako je barvení tetramerů MHC , kde účinky avidity zlepšují schopnost molekul MHC připojených ke streptavidinu detekovat specifické T buňky [14] . V jiných případech, jako je použití streptavidinu k vizualizaci specifických proteinů na buňkách, může polyvalence narušit funkci sledovaného proteinu. Monovalentní streptavidin je uměle vytvořená rekombinantní forma streptavidinu, což je tetramer, ale pouze jedno ze čtyř vazebných míst je funkční. Toto jediné vazebné místo má afinitu 10 −14 mol/l a nemůže způsobit zesítění [15] . Aplikace monovalentního streptavidinu zahrnovaly fluorescenční sledování receptorů buněčného povrchu , zdobení DNA origami a působení jako ukazatel pro identifikaci specifických oblastí pro kryoelektronovou mikroskopii .
Monomerní streptavidin je rekombinantní forma streptavidinu s mutacemi pro štěpení tetrameru na monomer a zvýšení rozpustnosti výsledné izolované podjednotky. Monomerní verze streptavidinu mají afinitu k biotinu 10 −7 mol/l 10 −8 mol/l, a proto nejsou ideální pro značení, ale jsou užitečné pro čištění tam, kde je požadována reverzibilita [16] [17] .
DvojmocnýStreptavidin s přesně dvěma biotinovými vazebnými místy na tetramer lze připravit smícháním podjednotek s funkčním biotinovým vazebným místem a bez něj a čištěním iontoměničovou chromatografií . Funkční vazebná místa zde mají stejnou stabilitu vazby biotinu jako streptavidin divokého typu. Divalentní streptavidin se dvěma vazebnými místy biotinu společně (cis-bivalentní) nebo odděleně (trans-bivalentní) lze purifikovat samostatně [18] .
TrivalentníStreptavidin s přesně třemi vazebnými místy pro biotin na tetramer lze také připravit za použití stejného principu jako pro divalentní streptavidiny [19] .
Vysokovalenční streptavidinyStreptavidiny s vyšší valenční schopností byly vytvořeny pomocí chemie konjugace izopeptidových vazeb pomocí technologie SpyTag/SpyCatcher [20] . To naznačuje, že tetramer streptavidinu se třemi vazebnými místy biotinu a mrtvým streptavidinem fúzovaným buď se SpyTag nebo SpyCatcher. Když se různé tetramery smíchají dohromady, vytvoří se kovalentní vazba poskytující více vazebných míst pro biotin. Touto metodou bylo vytvořeno šest a dvanáct vazebných míst pro biotin na molekulu.
Streptavidin není jediným proteinem, který dokáže vázat biotin s vysokou afinitou. Avidin je další nejznámější protein vázající biotin. Avidin, původně izolovaný z vaječného žloutku, má pouze 30% sekvenční identitu se streptavidinem, ale téměř identickou sekundární, terciární a kvartérní strukturu. Avidin má vyšší afinitu k biotinu ( Kd ~ 10–15 M ), ale na rozdíl od streptavidinu je avidin glykosylovaný, kladně nabitý a má pseudokatalytickou aktivitu (avidin může zvýšit alkalickou hydrolýzu esterové vazby mezi biotinem a nitrofenylem). skupina) a má vyšší tendenci k agregaci. Na druhé straně je streptavidin nejlepším pojivem pro biotinový konjugát; avidin má nižší vazebnou afinitu než streptavidin, když je biotin konjugován s jinou molekulou, navzdory skutečnosti, že avidin má vyšší afinitu k volnému, nekonjugovanému biotinu. Protože streptavidin nemá žádnou sacharidovou modifikaci a má téměř neutrální pí , má výhodu mnohem nižší nespecifické vazby než avidin. Deglykosylovaný avidin (NeutrAvidin) je srovnatelnější co do velikosti, pí a nespecifické vazby na streptavidin.
Skupiny zkoumající a vyvíjející streptavidin nebo proteiny rodiny avidinů (v abecedním pořadí)