Transfekce

Aktuální verze stránky ještě nebyla zkontrolována zkušenými přispěvateli a může se výrazně lišit od verze recenzované 21. února 2020; kontroly vyžadují 2 úpravy .

Transfekce  je proces zavedení nukleové kyseliny do eukaryotických buněk nevirovou metodou [1] . Podobný proces ve vztahu k prokaryotům se nazývá transformace .

Transfekce obvykle zahrnuje vytvoření otvorů v plazmatické membráně , kterými může extracelulární materiál vstoupit do buňky. Genetický materiál, jako je DNA nebo RNA , může být transfekován , stejně jako proteiny , jako jsou protilátky . Pro transfekci se často používá silné elektrické pole ( elektroporace ) nebo elektrostaticky nabité lipidy , schopné tvořit liposomy , struktury, které se spojí s plazmatickou membránou a vypudí materiál v nich uzavřený do buňky. Jsou známy i jiné způsoby transfekce.

Původní význam slova transfekce : infekce pro transformaci, tedy vnesení virového genomu do buněk , v důsledku čehož začíná infekce. Ale protože termín transformace má v aplikaci na lidi a zvířata jiný význam (genetické změny, které umožňují buňkám udržet v kultuře dlouhou dobu, překonávají Hayflickův limit , který je typický například pro rakovinné buňky), termín transfekce byl navržen jako náhrada za termín transformace ve smyslu změny fenotypu zavedením cizí nukleové kyseliny.

Metody transfekce

Materiály používané pro transfekci jsou tří hlavních typů: mikročástice, kationtové polymery a liposomy.

Jednou z nejlevnějších a nejméně spolehlivých metod je transfekce fosforečnanem vápenatým, vynalezená v 70. letech [2] [3] ). Izotonický roztok obsahující HEPES pufr , fosfát a DNA se smíchá s chloridem vápenatým. Vznikne sraženina z částic fosforečnanu vápenatého a DNA, jejíž velikost leží v řádu nanometrů. Suspenze se přidává do buněčné kultury, která absorbuje částice (jak přesně, autoři neuvedli). Tato transfekce funguje nejlépe s buňkami lidských embryonálních ledvinových buněk linie 293 (HEK 293), ale mnoho dalších linií je transfekováno s poněkud nižší účinností.

Účinnější metoda využívá lipozomy, struktury, které jsou mnohem menší velikosti než buňky, sestávající z lipidové membrány obklopující DNA ve vodné fázi. Jejich struktura připomíná strukturu buněk, které jsou rovněž obklopeny fosfolipidovou membránou. Lipozomy mohou splynout s buněčnou membránou, načež jejich vnitřní prostor splyne s obsahem buněk. Pro tvorbu lipozomů se obvykle používají kladně nabité lipidy, protože DNA a buněčné fosfolipidy jsou nabité záporně a částice s různými elektrostatickými náboji jsou k sobě přitahovány.

Dalším způsobem transfekce je použití pozitivně nabitých ve vodě rozpustných polymerů, jako je DEAE-dextran nebo polyethylenimin. Záporně nabitá DNA váže polykationty a výsledný komplex je přijímán buňkami endocytózou .

DNA může být také zavedena do buněk mikroinjekcí nebo pomocí „ genové pistole “. Ten využívá mikročástice inertní pevné látky (obvykle zlata), ke kterým je DNA fúzována.

Impalefekce je metoda dodávání genů pomocí nanomateriálů , jako jsou uhlíková nanovlákna , uhlíkové nanotrubice , nanodrátky . Jehlovité nanostruktury jsou syntetizovány kolmo k povrchu substrátu. Plazmidová DNA obsahující gen a určená pro intracelulární dodání je připojena k povrchu nanostruktury. Čip s řadou takových jehel je pak přitlačen proti buňkám nebo tkáním. Buňky vystavené nanostrukturám mohou exprimovat dodaný gen (geny).

Jiné metody transfekce zahrnují elektroporaci , nukleofekci, tepelný šok, použití magnetických částic a řadu komerčních činidel distribuovaných výrobci výzkumných produktů.

Navíc DNA může být do buněk dodávána viry. V tomto případě se proces nazývá transdukce a buňky jsou transdukovány.

Transfekce je stabilní a přechodná

K vyřešení problému často stačí zavést DNA do buněk pouze na nějakou dobu, která je dostatečná pro její expresi . Protože transfekovaná DNA není normálně inkorporována do jaderného genomu a nereplikuje se, cizí DNA se rychle ztrácí, když buňky proliferují. Taková transfekce se nazývá přechodná .

Pokud je nutné fixovat zavedený gen v potomstvu transfekovaných buněk, pak by měl být zahrnut do jaderného genomu. Taková transfekce se nazývá stabilní . K tomu je do buněk zaveden další gen, který usnadňuje selekci transfekovaných buněk, a proto se nazývá selekční marker . Například selekční marker může být gen rezistence na nějaké antibiotikum . Některé buňky zcela náhodně obsahují cizí DNA ve svém genomu a úkolem v tomto případě je pouze vybrat potomstvo takových buněk (klon), což lze snadno provést v přítomnosti antibiotika, které je škodlivé pro všechny buňky kromě transfekovaných. .

Geneticin, také známý jako G418, puromycin, doxymycin atd., se často používají jako antibiotika pro selekci transfekovaných buněk.

K integraci cizí DNA do buněčného genomu dochází díky přítomnosti opravného mechanismu v buňce . Proto je účinnost inzerce zvýšena, pokud je DNA zavedená do buněk lineární spíše než kruhová, jak jsou obvykle bakteriální plazmidy . Přítomnost restrikčních enzymů v buňkách samozřejmě do jisté míry zajišťuje náhodnou linearizaci kruhových plazmidů, ale může k ní dojít i podle selekčního genu nebo genu, který by měl být integrován do genomu. Proto jsou geneticky upravené konstrukty obvykle předlinearizovány při přípravě stabilní transfekce.

Ještě více přípravných prací vyžaduje vložení genu do konkrétního místa v genomu, což je nutné například pro genetický knockout . V tomto případě by v geneticky upraveném konstruktu měla být kazeta genů zavedená do chromozomu umístěna mezi dvěma úseky komplementárními k chromozomální DNA, dlouhé 1000-3000 párů bází (takzvaná ramena ).

Poznámky

  1. ↑ Transfekce (downlink) . Datum přístupu: 26. září 2008. Archivováno z originálu 17. prosince 2008. 
  2. ↑ Graham FL, van der Eb AJ Nová technika pro stanovení infekčnosti DNA lidského adenoviru 5  //  Virology : journal. - 1973. - Sv. 52 , č. 2 . - str. 456-467 . - doi : 10.1016/0042-6822(73)90341-3 . — PMID 4705382 .
  3. ↑ Bacchetti S., Graham F. Přenos genu pro thymidinkinázu do thymidinkinázově deficitních lidských buněk pomocí depletované virové DNA herpes simplex  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America  : journal  . - 1977. - Sv. 74 , č. 4 . - S. 1590-1594 . - doi : 10.1073/pnas.74.4.1590 . — PMID 193108 .

Literatura

Odkazy

  Přejděte na položku Wikidata  Slovníky a encyklopedie