Elektroporace

Aktuální verze stránky ještě nebyla zkontrolována zkušenými přispěvateli a může se výrazně lišit od verze recenzované 27. ledna 2022; kontroly vyžadují 2 úpravy .

Elektroporace  je vytvoření pórů v dvojvrstvé lipidové membráně pod vlivem elektrického pole. Tento jev se používá v biotechnologii k zavedení makromolekul (obvykle DNA nebo RNA ) do savčích , bakteriálních nebo rostlinných buněk a používá se také v lékařství a průmyslu.

Zesílení elektrického pole při elektroporaci

Fenomén elektroporace je založen na skutečnosti, že membrány mají schopnost koncentrovat elektrické pole. Nechť je mezi dvěma plochými rovnoběžnými elektrodami umístěnými ve vzdálenosti L aplikován potenciálový rozdíl U a mezera mezi nimi je vyplněna slabě vodivým elektrolytem. Poté je intenzita pole rovnoměrně rozložena po celém prostoru mezi nimi. Nyní umístíme do středu buňky dvouvrstvou lipidovou membránu, která má tak vysoký odpor, že ji lze považovat za nevodivé dielektrikum. Pak se celý potenciálový rozdíl U soustředí na membránu.

Zisk elektrického pole bude samozřejmě roven L/h ~ 10^6, pokud zvolíme L ~ 1 cm, h ~ 5 nm. V souladu s experimentálními výsledky tedy stačí na elektrody aplikovat potenciálový rozdíl v řádu stovek milivoltů, aby se vyvolala elektroporace dvojvrstvy. Pokud jsou nyní mezi elektrodami články o průměru asi 10 mikronů a my chceme způsobit jejich elektroporaci, bude nutné použít mnohem vyšší napětí. Vzhledem k vysokému odporu membrány bude roztok v článku ekvipotenciální, to znamená, že vnější pole bude stíněno pohyblivými ionty, které tvoří difúzní desky dvojitých elektrických vrstev. Napěťový skok na článku tedy bude 2UR/L, který se soustředí na membránu v oblasti dvou pólů článku. Pokud připustíme, že je nutné mít řekněme 0,5 V, pak bude nutné na elektrody aplikovat U ~ L / R * 0,5 V. Tedy, když máme L ~ 1 cm, R ~ 5∙10^-4 cm, dostaneme U ~ (1∙0,5)/(5∙10^(-4)) ~ 1 kV. Proto je při experimentech s buněčnými suspenzemi a lipozomy nutné použít speciální elektroporátory schopné generovat krátké pulzy s amplitudou do 1–10 kV.

Při aplikaci pulzů elektrického pole o síle od několika stovek do několika tisíc voltů na cm a trvání od desítek mikrosekund do desítek milisekund na buněčnou suspenzi, je možné způsobit prudké zvýšení vodivosti buněčných membrán. Po mírném elektrickém ošetření klesne vodivost buněk na normální hodnoty během několika sekund až několika minut. Intenzivnější elektrické ošetření vede k nevratné destrukci některých buněk.

Při experimentech s články je obtížné řídit napětí aplikované přímo na buněčnou membránu. Kromě toho je buněčná membrána extrémně složitý systém. Hlavní bariérové ​​funkce membrány jsou vykonávány fosfolipidovou dvojvrstvou, která je prostoupena proteiny, které působí jako selektivní kanály nebo aktivní pumpy pro ionty a metabolity. Možnými důvody pro zvýšení elektrické vodivosti by mohly být změny jak v lipidové dvojvrstvě, tak v proteinech. Experimenty s umělou dvojvrstvou lipidovou membránou (BLM) ukázaly možnost jejího elektrického rozpadu při napětích blízkých těm, při kterých je pozorován rozpad v buněčné membráně. Ukázalo se, že elektrický průraz BLM určitého složení může být reverzibilní. To naznačuje, že je to právě rozpad lipidové složky, která je zodpovědná za zvýšení permeability buněk. Experimenty s BLM ukázaly, že k elektrickému průrazu dochází stochasticky a průměrná životnost membrány závisí nelineárně na napětí. Tato pozorování vedla k rozvoji teorie vzniku a vývoje pórů v kapalných lipidových dvojvrstevách v elektrickém poli. Koncem 90. let bylo pomocí vysoce přesných měření vodivosti membrány možné zaregistrovat výskyt jednotlivých elektropórů v BLM. Jejich průměrný průměr je asi 0,5 nm. V buněčných membránách byly detekovány pomocí elektronové mikroskopie.

Teorie membránové elektroporace

Teorie BLM elektroporace naznačuje, že v dvojvrstvé lipidové membráně dochází k místnímu přeskupení struktury, což vede ke vzniku průchozího vodního kanálu. Jsou možné dvě základní konfigurace pórů, hydrofilní a hydrofobní. V hydrofobním póru jsou stěny pórů lemovány lipidovými konci, zatímco v hydrofilních pórech jsou lemovány fosfolipidovými hlavami. U malých poloměrů je energeticky výhodný hydrofobní pór a u velkých poloměrů hydrofilní pór. Voda má vyšší dielektrickou konstantu než lipidy. Proto má membrána obsahující póry méně energie ve vnějším elektrickém poli. Tento energetický zisk je úměrný ploše póru a kvadratický v jeho poloměru. Při poloměru pórů r* se energie hydrofobních a hydrofilních pórů vyrovnají. Na energetické křivce je lokální minimum odpovídající metastabilnímu vodivému stavu dvojvrstvy, ze kterého s určitou frekvencí přechází do výchozího nenarušeného stavu s nízkou vodivostí soustavy, případně dochází k přerušení. Rychlost tvorby hydrofilních pórů v lipidové dvojvrstvě o jednotkové ploše (Kc) lze popsat rovnicí

kde

,

Zde a je plocha na jednu molekulu lipidu, d je tloušťka dvojvrstvy,  je vakuová dielektrická konstanta,  je dielektrická permitivita dvojvrstvy,  je permitivita vody, k je Boltzmannova konstanta,  je frekvence laterálních fluktuací lipidové molekuly,  je poloměr pórů odpovídající přechodovému stavu, T je teplota, U je elektrické napětí přes dvojvrstvu,  je aktivační energie póru v nepřítomnosti elektrického pole.

Předpokládá se, že rychlost přerůstání pórů nezávisí na použitém elektrickém poli a hustotě pórů na dvojvrstvě.

Dodání makromolekul do buněk elektroporací

Výše popsané experimenty byly ve skutečnosti zredukovány na měření elektrického proudu přenášeného malými ionty skrz póry. Spolu s tím bylo zjištěno, že elektrické zpracování podporuje přenos přes membrány makromolekul, jejichž velikost přesahuje průměr elektropórů. Navíc byla zaznamenána korelace mezi elektroporací a transportem velkých molekul. Ve vědeckých pracích bylo na příkladu transportu molekul DNA prokázáno, že jsou schopny rozšiřovat póry, které se pak pomalu (~ 100 sec.) uvolňují do původního stavu. Navíc tamní přímé experimenty také ukázaly, že elektroforéza DNA hraje důležitou roli nejen ve fázi přenosu těchto molekul do buňky, ale také při průchodu membránou. Elektrické pole doslova vtlačí plazmidovou DNA do malého póru a zároveň ji rozšíří. Můžeme říci, že samotné molekuly plazmidové DNA hrají roli zlatých mikroskopických střel, které se používají v metodě „gene gun“. Jen hnací síly jsou jiného charakteru – v prvním případě elektrické, v druhém mechanické. Další důležitou inovací realizovanou ve vědeckých pracích je použití 2pulzní techniky elektrického zpracování, která umožnila oddělit v čase dvě funkce pole - elektroporaci a elektroforetickou. První impuls byl silný, ale krátký; pak následoval interval proměnného trvání a nakonec bylo zapnuto slabé konstantní pole. Zavedení DNA před prvním pulzem mělo za následek vysokou transfekci a přenos velkých molekul dextranu, zatímco zavedení DNA během interpulzního intervalu nemělo prakticky žádný efekt.

V posledním desetiletí se elektroporace používá k transdermálnímu přenosu léčiv do lidského těla. Elektroporace je základem několika transdermálních přenosových technik označovaných jako aquaforéza , neinvazivní mezoterapie , bezjehlová mezoterapie nebo bezinjekční mezoterapie.

Lékařské aplikace

Metoda elektroporace se využívá při léčbě onkologických onemocnění: nevratná elektroporace nádoru vede k lokální destrukci jeho buněk, mikrosekundové elektrické impulsy 2000-3000 voltů v membránách nádorových buněk vytvářejí mikropóry, což vede k narušení buněčné homeostázy a buněčná smrt [1] .

Průmyslové aplikace

Průmyslové závody na elektroporaci produktů (technologie se nazývá PEF - pulzní elektrické pole) se používají jako jedna z fází výrobního procesu: při přípravě džusů a smoothies jako šetrnější metoda dezinfekce než pasterizace nebo ultrapasterizace , a při výrobě mražených a sušených produktů - pro lepší zachování organoleptických vlastností produktů, snížení spotřeby vody a výrobních ztrát. Přední světovou firmou v zavádění technologie do výroby potravin je Elea GmbH z Německa [2] .

Poznámky

  1. ↑ Záchranou pro pacienta s inoperabilním adenokarcinomem pankreatu byla metoda ireverzibilní elektroporace . www.ronc.ru _ Národní výzkumné centrum onkologie pojmenované po N.N. N. N. Blokhin (21. ledna 2022). Staženo: 27. ledna 2022.
  2. ↑ Elea GmbH  . www.potatopro.com . Staženo: 18. ledna 2022.

Odkazy