DNA agarózová gelová elektroforéza je analytická metoda používaná k oddělení fragmentů DNA podle délky. Je založena na různé rychlosti pohybu různě dlouhých úlomků při pohybu v gelu působením vnějšího elektrického pole .
Jednou z aplikací metody je studium plazmidové DNA. Obvykle je prstencový a tvoří sekundární struktury, jako je svinutí do supercoil . K určení velikosti plazmidu je tedy nutné zničit prvky sekundární struktury. Za tímto účelem se plazmid před aplikací na gel „linearizuje“ (lineární), to znamená, že se na něj působí jedním z restrikčních enzymů (endonukleáz). Restrikční enzym je zvolen tak, aby štěpil plazmid pouze na jednom místě.
K separaci fragmentů DNA různých délek se používá gel s různými koncentracemi agarózy. Čím kratší je délka fragmentů DNA, které mají být odděleny, tím vyšší by měla být koncentrace agarózy:
| Délka fragmentů DNA, které mají být odděleny, bp |
Koncentrace agarózy , % |
|---|---|
| 50-1500 | 2 |
| 300-3000 | 1.5 |
| 400-6000 | 1.2 |
| 500-10000 | jeden |
| 800-10000 | 0,7 |
| 1000-20000 | 0,5 |
Během elektroforézy migrují fragmenty DNA v gelu pod vlivem sil elektrického pole . Faktem je, že cukr-fosfátová kostra molekul DNA je záporně nabitá, a proto se řetězce DNA pohybují od záporně nabité katody ke kladné anodě . Delší molekuly migrují pomaleji, když zůstávají v gelu, kratší molekuly se pohybují rychleji.
Před zahájením elektroforézy je zvykem přidávat do vzorků dvě různá barviva s kyselým pH (k tomuto účelu se často používá xylenová modř a bromfenolová modř ), aby bylo možné vizualizovat průběh elektroforézy a vážit vzorky glycerolem (až 20 % glycerolu ve vzorku). Barvivo je také potřebné k určení, kdy proces zastavit.
Elektroforéza se provádí v komoře naplněné tlumivým roztokem . Nejčastěji používané pufry obsahují EDTA , Tris a kyselinu boritou nebo octovou. V souladu s tím se pufr obsahující kyselinu boritou nazývá TBE (tris-boritan-EDTA) a pufr obsahující kyselinu octovou se nazývá TAE (tris-acetát-EDTA). Koncentrace matečných louhů TBE a TAE jsou 6x, resp. 50x ve srovnání s jejich pracovními koncentracemi. Pufr je nezbytný pro zvýšení iontové síly roztoku, ve kterém dojde k separaci molekul DNA působením aplikovaného elektrického pole.
Po separaci (někdy je barvivo přidáno do roztavené agarózy) jsou fragmenty DNA různých délek vizualizovány pomocí fluorescenčních barviv, která specificky interagují s DNA, například agarózové gely jsou obvykle obarveny ethidium bromidem , který interkaluje mezi dusíkatými bázemi duplexu a fluoreskuje v UV záření.
Velikost se provádí porovnáním sad komerčních fragmentů DNA známé délky („žebříček DNA“, „pravítko“, „markery DNA“) a DNA v testovaných vzorcích. Obvykle je obsah jednotlivých fragmentů indikován i v komerčních markerech, takže porovnáním intenzity pásů je možné rychle posoudit koncentraci DNA v testovaných vzorcích. Pokud je to nutné, mohou být DNA markery pro gel vyrobeny nezávisle ošetřením plazmidu restrikčním enzymem, který jej štěpí na několika místech. K tomu je vybrána endonukleáza, při jejímž působení se vytvoří 5-6 fragmentů různých délek.
Obvykle se pro elektroforetickou analýzu DNA používají agarózové gely, ale pokud jsou fragmenty DNA, které mají být separovány, dlouhé pouze několik desítek párů bází, lze použít polyakrylamidový gel. Polyakrylamidový gel se také používá pro krátké molekuly DNA s vysokým rozlišením při sekvenování DNA .