Cholerový toxin ( cholerog [1] ) je vícepodjednotkový proteinový exotoxin produkovaný Vibrio cholerae . Vibrio (virulentní kmen Vibrio cholerae [1] [2] vylučuje toxin cholery po vstupu bakterie do lidského těla. Působení CT způsobuje intenzivní dehydrataci po nástupu aktivní fáze cholerové infekce . Při průniku do buněk infikovaný organismus, jedna z podjednotek tohoto toxinu katalyzuje ADP-ribosylaci Gsα-složka adenylátcyklázy , což vede k její hyperaktivaci [2] .. Zvýšená aktivita adenitalcyklázy vede k narušení transportu iontů přes membránu střevních buněk : příjem ubývá sodíkových iontů (a s nimi vody) a zvyšuje se odtok aniontů (a s nimi i vody) V důsledku toho dochází k rychlé ztrátě vody střevními buňkami, která v některých případech dosahuje až dvou litrů za hodinu.
Cholerový toxin je oligomerní protein sestávající ze šesti podjednotek. Jednou z těchto podjednotek je typ A. Tato podjednotka má katalytickou aktivitu. Zbývajících pět podjednotek je typu B. Jsou nezbytné pro vazbu toxinu cholery na protein lidského receptoru buňky. Prostorovou strukturu cholerového toxinu získali Zhang et al. (Zhang et al.) v roce 1995.[3] B podjednotky cholerového toxinu jsou malé proteiny. Molekulová hmotnost B podjednotky je 12 kDa. V molekule toxinu cholery tvoří podjednotky B kruh. V podjednotce A se rozlišují dvě domény spojené disulfidovou vazbou: A1 (CTA1) je enzym, který váže ADP-ribózu na G-proteiny, A2 (CTA2) má formu alfa šroubovice, která se nachází uvnitř pěti -členný kruh tvořený podjednotkami B. [čtyři] Struktura toxinu cholery, katalytický mechanismus a sekvence jsou podobné toxinu coli.
Cholerový toxin vstupuje do střevních epiteliálních buněk (enterocytů) prostřednictvím receptorově závislé endocytózy . V cytoplazmě buňky se obnoví disulfidová vazba mezi doménami A1 a A2 a A1 (CTA1) se z komplexu disociuje. Podjednotka A1 má schopnost připojit ADP-ribózu k trimerní Gsa složce adenylátcyklázy. V důsledku této reakce se aktivuje adenylátcykláza a začne syntetizovat cAMP. Na druhé straně cAMP spustí signální dráhu , která vede k odtoku chloridových iontů a dalších aniontů z buňky přes CFTR kanály a k zastavení vstupu sodíkových iontů do buňky. Spolu s anionty dochází k dalšímu odtoku sodíkových iontů. Sodné ionty jsou kotransportovány s molekulami vody, takže koncentrace vody v buňce při těchto procesech je výrazně snížena. Porušení rovnováhy voda-sůl vede k průjmu, při kterém tělo ztrácí až 2 litry vody za hodinu. Dochází k dehydrataci a stolice pacienta díky enterocytům odděleným od střevní stěny získává charakteristickou konzistenci „rýžové vody“. Je pozoruhodné, že pertusový toxin (také pětipodjednotkový protein AB5) produkovaný Bordetella pertussis působí na lidské tělo podobným způsobem, kromě toho, že pertusový toxin připojuje ADP-ribózu k podjednotce Gai a udržuje ji v neaktivním stavu. Inaktivita Gai zabraňuje inhibici lidské adenylátcyklázy a zvyšuje syntézu cAMP v buňce [6].
Po sekreci se podjednotka B cholerového toxinu váže na gangliosid GM1 umístěný na vnější buněčné membráně enterocytu. Po navázání se toxin cholery (celý komplex) dostává do buňky endocytózou. V této fázi je prstenec zničen a díky obnově disulfidických vazeb se uvolní doména CTA1, která byla dříve součástí podjednotky A. Endosom se dostává do Golgiho aparátu, kde CTA1 interaguje s chaperonem endoplazmatického retikula, proteinem disulfidizomeráza, se odvíjí a je transportován chaperonem do oblasti buněčné membrány přes kanál Sec61. V membráně CTA1 interaguje s oxidoreduktázou Ero1, CTA1 se uvolňuje z komplexu s chaperonem v důsledku oxidace a záhybů takovým způsobem, aby se zabránilo ubikvitinaci buněčnými enzymy a následné destrukci. CTA1 se poté váže na ADP-ribosylační faktor 6 (Arf6), který stimuluje katalytickou aktivitu CTA1. Komplex CTA1 a Arf6 tedy štěpí NAD a přenáší výslednou ADP-ribózu na G-protein, regulační podjednotku endogenní adenylátcyklázy. To vede k tomu, že Gαs si zachovává schopnost vázat GTP, ale ztrácí schopnost jej hydrolyzovat, to znamená, že zůstává v aktivovaném stavu. V důsledku toho se cAMP hromadí v buňce. Obecně se jeho koncentrace může zvýšit více než 100krát.
Gen, který kóduje toxin cholery, mohl vzniknout u V. cholerae prostřednictvím toho, co je známé jako horizontální přenos genů . Virulentní kmeny Vibrio cholerae jsou infikovány bakteriofágem CTXf nebo CTXφ ;[7]
Navzdory svému impozantnímu názvu má cholerový toxin poměrně mírové využití. V oblasti výzkumu kmenových buněk je cholerový toxin široce používán jako přísada do kultivačních médií . To je nezbytné k zabránění diferenciace buněk a udržení určité úrovně proliferace v buněčné kultuře . Koncentrace toxinu cholery v kultivačním médiu je 0,1 nmol/l.
Podjednotka B, která sama o sobě není cytotoxická , se používá jako indikátor. Podstatou metody je, že fluorescenční značka nebo protilátka ( molekula imunoglobulinu G ) je chemicky přišita k B podjednotce . Vazbou na buňku nesoucí specifický gangliosid modifikovaná B podjednotka značí buňku.
Patogenita cholerového toxinu jako takového ve formě roztoku, aerosolu apod. se zdá být pochybná. Protein jako takový nevzniká in vivo v nepřítomnosti vibria, jeho účinek na buňky je výrazně časově omezený a stejně jako všechny ostatní proteiny podléhá degradaci v trávicím traktu.
Na trhu s biologickými látkami se cholerový toxin prodává v malých sériích, jako je Sigma-Aldrich , v 10mg balení, což minimalizuje riziko jeho úmyslného nebo nevhodného použití mimo zdi vědecké laboratoře.