DNáza-sekv

Testování DNase-Seq nebo DNase susceptibility  je molekulárně biologická metoda, spolu s FAIRE-Seq , používaná k určení polohy regulačních oblastí. Metoda je založena na sekvenování oblastí hypersenzitivních na štěpení DNázy I. DNase-Seq se používá ke stanovení globální distribuce míst štěpení DNázy I a tedy otevřeného chromatinu, kde jsou často lokalizovány regulační prvky. DNase-Seq je zvláště atraktivní pro identifikaci regulačních prvků, protože se nespoléhá na přítomnost nebo specificitu protilátek.

Teoretické zdůvodnění

Balení DNA do nukleozomů hraje strukturující roli a je důležitým faktorem pro transkripci, který určuje schopnost DNA vázat se na proteiny. To usnadňuje replikaci a koordinaci genové aktivity [1] .

Pokud jde o přístupnost chromatinu, rozlišují se dvě jeho konformace - otevřené a uzavřené. Uzavřená konformace odpovídá DNA sbalené do nukleozomů a struktur vyšších řádů. Časné studie ukázaly, že oblasti DNA mimo nukleozom (otevřená konformace) jsou přecitlivělé na DNázu I a jsou zodpovědné za aktivaci genu [2] [3] [4] [5] [6] . Za posledních 25 let byly konvenčním Southern blotem identifikovány stovky hypersenzitivních míst. Mapování těchto míst významně přispělo k identifikaci různých typů regulačních prvků genomu — promotorů, zesilovačů, tlumičů a izolátorů. Identifikace aktivních prvků genové regulace je nezbytná pro pochopení regulace biologických procesů na úrovni transkripce [7] . Tyto procesy zahrnují diferenciaci, vývoj, proliferaci buněk a jejich reakci na vlivy prostředí.

Metoda DNase-seq, poprvé popsaná v roce 2008, je založena na selektivním štěpení DNázou I těchto oblastí důležitých pro regulaci biologických procesů, které nejsou součástí nukleozomů.

Postup

• homogenní buněčná kultura
• deoxynukleosidtrifosfáty
• streptavidinová zrna
• linkery jsou anelované oligonukleotidové sekvence
• sekvenační primer
• primery pro PCR
• T4 DNA ligáza
• T4 DNA polymeráza

1. Izolace jader
   • Po odstředění a promytí pufrem s asi 50 miliony buněk se výsledná suspenze důkladně promíchá s lyzačním pufrem.
   • Obarvením trypanovou modří zkontrolujte kvalitu lýzy. Pokud byla lýza úspěšná, mělo by se obarvit 99 % buněk.
   • Centrifugujte pro peletizaci jader a úplně odstraňte supernatant.
2. Štěpení DNázou I a inkorporace DNA do agarózy
3. Identifikace produktů ošetření DNázou elektroforézou v PFG (gel pulzního pole).
4. Tupení výsledných vyčnívajících konců
5. Vytvoření knihovny. Dva páry oligonukleotidových sekvencí jsou spojeny za vzniku dvou linkerů. Konce ošetřené DNázou jsou pak ligovány k jednomu z linkerů. Poté by měly být neligované linkery odděleny od ligované DNA a navzájem izolovány.

Ligovaná DNA je poté ošetřena restrikční endonukleázou Mmel, což vede k defosforylovaným koncům. Musí být ligovány k druhému (fosforylovanému) linkeru.

Tak se získá produkt DNase-seq. Je amplifikován a s amplifikačním produktem se provádí elektroforéza.

Po mapování čtení je odstraněn šum pozadí z náhodného štěpení DNázy I (který je obvykle mnohem slabší než ten skutečný) porovnáním signálu v této poloze s velkou přilehlou oblastí a očekávaným signálem pozadí. Ostré hranice mezi sousedními DHS jsou vyhlazeny v programech jako F-seq [8] , založených na algoritmech jako HotSpot, optimalizovaných pro práci s daty získanými pomocí různých protokolů [9] [10] [11] .

• Metoda funguje pouze pro čerstvě připravené vzorky a vylučuje použití zmrazených nebo jinak fixovaných vzorků.
• Doba lýzy a koncentrace detergentu musí být optimalizovány pro dosažení maximální účinnosti lýzy a zachování většiny jader neporušených. V případě úspěšné lýzy by měl být počet získaných jader v porovnání s počátečním počtem buněk v rozmezí 80-100 %.
• Screening velikosti před a během výstavby knihovny přímo ovlivňuje prezentaci silných a slabých míst DNázy I.
• Monitorování účinnosti obohacení a specificity DNázy I pomocí kvantitativní PCR nebo Southern blottingu je důležité pro zlepšení získaných dat. Na základě těchto dat lze upravit koncentraci DNázy I tak, aby bylo dosaženo optimálního obohacení.

• Podle metody se doporučuje analyzovat 50 milionů buněk. Co dělat, když není dostatek buněk?
  • Experimenty byly také prováděny s menším počtem buněk. Je možné přepočítat koncentrace a objemy v poměru k počtu buněk, obecně však platí, že všechny proporce jsou určeny empiricky na základě počtu a typu buněk.
• Buňky byly špatně lyzovány nedostatečně nebo naopak nadměrně. Nadměrná lýza buněk může vést k jejich adhezi a precipitaci.
  • Je nutné zvolit správnou koncentraci lyzačního činidla. Různé buněčné linie mají různou citlivost k takovým činidlům. Různé koncentrace by měly být testovány na malém počtu buněk (5 milionů).
• DNA nebyla úplně nebo nadměrně štěpena DNázou.
  • Stejně jako v případě lýzy hraje rozhodující roli koncentrace. Pokud není řezání dostatečně účinné, zvyšte koncentraci enzymu nebo dobu zpracování nebo odeberte menší počet buněk. V případě nadměrného zpracování by měl být účinek DNázy snížen a měla by být užívána v nižší koncentraci.

Srovnání s jinými metodami

Data DNase-seq korelují s daty DNase-ChIP. Výsledky získané oběma metodami korelují s výsledky kvantitativní PCR [12] . Mezi těmito metodami je však mnoho rozdílů. DNase-seq, na rozdíl od DNase-ChIP, se používá pouze pro experimenty s celým genomem. DNase-ChIP je méně přesná, ale flexibilnější a lze ji použít ke studiu jednotlivých oblastí genomu.

DNase-seq je přímá metoda použitelná na buňky jakéhokoli typu jakéhokoli druhu, jehož genom byl sekvenován [13] . DNase-seq je velmi vhodná pro identifikaci regulačních prvků genomu v první aproximaci. Tato metoda však přímo nevysvětluje biologické funkce těchto prvků. K určení funkcí regulačních prvků je třeba použít jiné metody, jako je imunoprecipitace chromatinu .

Existují bioinformatické algoritmy, které dokážou zpracovat surová experimentální data a provést důkladnější analýzu genomu. Například až do nukleotidu lze určit místa, kde se DNA navázala na proteiny, tzv. stopy bílkovin [14] . Pokud jsou proteinové stopy a hypersenzitivní místa seskupeny do shluků s jasnějšími biologickými funkcemi a korelovány s daty o regulačních sekvencích genomu, lze dojít k závěru, jak dostupnost chromatinu ovlivňuje interakci DNA s transkripčními faktory.

Existuje veřejně dostupný server obsahující data DNase- a ChIP-seq pro lidi a myši.

Projekt ENCODE

Jedním z cílů projektu ENCODE je zmapovat všechna hypersenzitivní místa v lidském genomu za účelem systematizace regulační DNA [15] . Pomocí vysoce výkonného sekvenování byl získán profil hypersenzitivních míst pro 125 typů lidských buněk. V důsledku toho bylo identifikováno 2,9 milionu hypersenzitivních míst. 34 % bylo specifických pro každý typ buněk a pouze malé množství bylo nalezeno ve všech typech buněk. Tato data dávají představu o velké složitosti regulace exprese v lidském genomu a počtu prvků, které tuto regulaci řídí [16] .

Zda a do jaké míry může DNase-seq nahradit ChIP-seq, je věcí budoucího výzkumu.

Poznámky

1. ↑ Cockerille P.N. Struktura a funkce aktivního chromatinu a hypersenzitivních míst DNázy I   // FEBSJ . - 2011. - Iss. 277 . — S. 2182–2210 .
2. ↑ Wu C. 5' konce genů tepelného šoku Drosophila v chromatinu jsou přecitlivělé na DNázu I   // Nature . - 1980. - Iss. 286 . - S. 854-860 .
3. ↑ Wu C, Wong YC, Elgin SC. Struktura chromatinu specifických genů: II. Narušení struktury chromatinu při genové aktivitě   // Buňka . - 1979. - Iss. 16 . - S. 807-814 .
4. ↑ Levy A, Noll M. Chromatinová jemná struktura aktivních a potlačených genů   // Nature . - 1981. - Iss. 289 . — S. 198-203 .
5. ↑ Gross DS, Garrard WT. Místa přecitlivělá na nukleázu v chromatinu  //  Annu Rev Biochem. - 1988. - Iss. 57 . — S. 159-197 .
6. ↑ Keene MA, Corces V, Lowenhaupt K, Elgin SC. Hypersenzitivní místa DNázy I v chromatinu Drosophila se vyskytují na 5' koncích oblastí transkripce  //  Proč Natl Acad Sci. - 1981. - Iss. 78 . - S. 143-146 .
7. ↑ Song L. a Crawford G.E. DNase-seq: technika s vysokým rozlišením pro mapování aktivních genových regulačních prvků napříč genomem ze savčích buněk  (anglicky)  // ColdSpringHarb.Protoc.. - 2010. - S. 1-11 .
8. ↑ Boyle, A.P., Guinney, J., Crawford, G.E., Furey, T.S. F-Seq: odhad hustoty vlastností pro vysoce výkonné sekvenční značky   // Bioinformatics . - 2008. - Iss. 24 . — S. 2537–2538 .
9. ↑ Sabo, PJ a kol. Objev funkčních nekódujících prvků digitální analýzou struktury chromatinu   // Proc . Natl. Akad. sci. USA. - 2004. - Iss. 101 . — S. 16837–16842 .
10. ↑ Hardison, RC, Taylor, J. Genomické přístupy k nalezení cis-regulačních modulů u zvířat   // Nat . Rev. Genet. - 2013. - Iss. 13 . - str. 469-483 .
11. ↑ Zeng, W, Mortazavi, A. Technické úvahy pro funkční sekvenační testy  //  Nature Immunology. - 2012. - Iss. 13 . - S. 802-803 .
12. ↑ Boyle AP, Davis S, Shulha HP, Meltzer P, Margulies EH, Weng Z, Furey TS, Crawford GE. Mapování a charakterizace otevřeného chromatinu napříč genomem ve vysokém rozlišení   // Buňka . - 2008. - Iss. 132 . - str. 311-322 .
13. ↑ Madrigal P, Krajewski P. Současné bioinformatické přístupy k identifikaci hypersenzitivních míst DNázy I a genomových stop z dat DNase-seq  //  Hranice genetiky. - 2012. - Iss. 3 . - str. 1-3 .
14. ↑ Hesselberth JR, Chen X, Zhang Z, Sabo PJ, Sandstrom R, Reynolds AP, Thurman RE, Neph S, Kuehn MS, Noble WS. Globální mapování interakcí protein-DNA in vivo digitálním otiskem genomu  //  Metody Nat. - 2009. - Iss. 6 . — S. 283-289 .
15. ↑ Thurman RE a kol. Přístupná chromatinová krajina lidského genomu   // Příroda . - 2012. - Iss. 489 . — S. 75-82 .
16. ↑ Zhang, W a kol. Genomová identifikace regulačních elementů DNA a protein-vazebných stop pomocí signatur otevřeného chromatinu v Arabidopsis  //  The Plant cell. - 2012. - Iss. 24 . — S. 2719-2731 .