Imunoprecipitace je metoda izolace proteinu z komplexních směsí, jako jsou buněčné lyzáty , séra a tkáňové homogenáty pomocí proteinově specifických protilátek . Imunoprecipitace umožňuje detekovat změny v expresi proteinů , charakterizovat proteiny, se kterými studovaný protein tvoří komplex, identifikovat vazebná místa proteinů s nukleovými kyselinami [1] .
Při provádění imunoprecipitace se protilátky vážou na mikrokuličky. Nejčastěji používané mikrokuličky jsou vyrobeny z agarózy . Mohou být také použity mikrokuličky s magnetickými vlastnostmi. Pomocí magnetu lze magnetické mikrokuličky nesoucí komplexy antigen-protilátka udržet ve zkumavce, zatímco složky vzorku, které se nenavázaly na protilátku, jsou z ní odstraněny [1] .
V závislosti na způsobu vazby protilátky na mikrokuličky existují tři technologie imunoprecipitace. Klasická technologie využívá mikrokuličky potažené proteinem A nebo proteinem G. Protein A, stejně jako protein G, se může vázat na Fc oblast široké škály protilátek. Protilátka specifická pro protein, který má být izolován, se inkubuje se směsí, ze které má být protein izolován. Po vytvoření komplexu secernovaného proteinu ( antigenu ) s protilátkou se do směsi zavedou mikrokuličky potažené proteinem A nebo proteinem G. Na mikrokuličky se navážou komplexy antigen-protilátka. Pomocí centrifugace a promytí se ze směsi oddělí mikrokuličky s asociovanými komplexy antigen-protilátka. Antigen a protilátka jsou eluovány z mikrokuliček. Někdy se do směsi přidávají mikrokuličky, na které se předtím navázaly protilátky. Hlavní nevýhodou klasické technologie je to, že elucí izolovaného proteinu z mikročástice dojde také k odstranění protilátky z mikročástice. V důsledku toho bude izolovaný protein kontaminován a protilátky nelze znovu použít [1] .
Kontaminaci izolovaného proteinu a ztrátě protilátek lze předejít imobilizací protilátek na mikročástici. Existují dvě technologie: imobilizace v důsledku kovalentního zesítění protilátky a proteinu A nebo proteinu G umístěného na povrchu mikročástice a imobilizace v důsledku vytvoření kovalentní vazby mezi protilátkou a materiálem mikročástice. Tyto technologie mají také své nevýhody. Nevýhodou kovalentního navázání protilátky na protein A nebo protein G je to, že síťovací činidlo může vytvářet kovalentní vazby na libovolných místech na protilátce, poškozovat aktivní místo a v důsledku toho protilátka ztrácí svou schopnost vázat antigen. Nevýhodou kovalentního spojení protilátky a materiálu mikročástic je, že na rozdíl od technologií proteinu A nebo proteinu G se na mikročástici naváže libovolná oblast protilátky, což může vést ke ztrátě schopnosti protilátky vázat antigen. [1] .
V situaci, kdy protilátky proti izolovanému proteinu nejsou dostupné, lze k němu přišít tag pomocí metod genetického inženýrství (například tag FLAG ), ke kterému jsou dostupné protilátky [2] .
Mezi výhody imunoprecipitace patří skutečnost, že při této metodě antigeny interagují s protilátkami v jejich nativní konformaci pro další separaci a kvantitativní analýzu. Navíc metoda imunoprecipitace umožňuje koncentrovat protein. Nevýhodou metody je, že pro účinnou detekci musí být protein radioaktivně označen [3] .
Koimunoprecipitace (Co-IP) je imunoprecipitace celého proteinového komplexu , která je založena na použití protilátky specifické pro jeden z proteinů, které tvoří komplex. Vazbou tohoto proteinu protilátka váže celý komplex. Díky tomu je možné identifikovat všechny proteiny, které tvoří komplex [1] .
Chromatinová imunoprecipitace (ChIP) je metoda pro nalezení vazebných míst studovaného proteinu vázajícího DNA v genomu . K tomu je DNA izolována z buňky a rozřezána na malé fragmenty a poté je provedena imunoprecipitace pomocí protilátek proti studovanému proteinu vázajícímu DNA. V důsledku toho se komplexy sestávající ze studovaného proteinu vázajícího DNA a fragmentu DNA vážou na protilátky . Takové fragmenty DNA jsou vazebnými místy studovaného proteinu vázajícího DNA v genomu. Pro čtení nukleotidové sekvence těchto DNA fragmentů se používají DNA microarrays (ChIP-on-chip) nebo moderní sekvenační metody (ChIP-seq) [4] [5] .
Imunoprecipitace RNA (RIP) je metoda, která umožňuje identifikovat molekuly RNA, které interagují se studovaným proteinem vázajícím RNA, a určit vazebná místa studovaného proteinu s molekulami RNA. Postup pro imunoprecipitaci RNA je podobný imunoprecipitaci chromatinu . Pro čtení nukleotidové sekvence izolovaných fragmentů RNA se používají DNA microarrays, které již dříve získaly molekuly DNA komplementární k vybraným fragmentům (RIP-čip), nebo moderní sekvenační metody (RIP-seq) [6] .