DNA microarray

Aktuální verze stránky ještě nebyla zkontrolována zkušenými přispěvateli a může se výrazně lišit od verze recenzované 10. října 2019; kontroly vyžadují 8 úprav .

DNA mikročip neboli DNA čip ( anglicky  DNA microarray ) je technologie využívaná v molekulární biologii a medicíně . DNA microarray je sada malých jednořetězcových molekul nazývaných DNA sondy , které jsou kovalentně připojeny k pevné bázi [1] [2] . Každá taková sonda má přesně definovanou nukleotidovou sekvenci a místo na mikročipu. Identické sondy jsou umístěny dohromady, aby vytvořily mikročipové místo. Mezi místem a sekvencí DNA sondy existuje vzájemná shoda. DNA microarrays se používají k identifikaci DNA nebo RNA (obvykle po reverzní transkripci), které mohou nebo nemusí kódovat proteiny. Měření genové exprese pomocí cDNA se nazývá expresní profil nebo expresní analýza. Na moderních microarrays je možné kompletně lokalizovat celý genom, jehož každý známý gen bude sondou [3] .

Princip metody

Činnost DNA mikročipů je založena na jevu hybridizace . V přítomnosti malého množství DNA testovaného vzorku se provádí amplifikace. U RNA se nejprve provede reverzní transkripce, která však není nutná: existují čipy, které pracují s DNA i RNA. Verifikace vzorků DNA / RNA spočívá ve značení vzorků různými fluorescenčními značkami pro následnou detekci a aplikaci vzorků na mikročip. DNA mikročip s naneseným vzorkem se nějakou dobu inkubuje, aby došlo k hybridizaci komplementárních jednořetězcových molekul, poté se čip promyje. Všechny nekomplementární vzorky DNA/RNA jsou z čipu smyty. Poté je mikročip naskenován laserem, který způsobí fluorescenci značených molekul vzorku. Mikroskop připojený k počítači vyhodnocuje fluorescenci každého místa DNA mikročipu a následně stanovuje sekvence hybridizované DNA, což umožňuje určit sekvenci DNA, RNA ze vzorku [4] .

Historie

Technologie DNA microarray pochází ze Southern blottingu  , techniky, při které se fragmentovaná DNA přenese na vhodný nosič a poté se pomocí sondy se známou nukleotidovou sekvencí stanoví obsah cílové sekvence ve vzorku. Poprvé byla sada různých DNA spojených do čipu použita v roce 1987 k určení rysů regulace genové exprese interferony [5] . Rané DNA mikročipy byly vyrobeny nakapáním mikromnožství cDNA na filtrační papír . Použití miniaturních čipů k určení znaků genové exprese bylo implementováno v roce 1995 [6] a kompletní eukaryotický genom ( Saccharomyces cerevisiae ) byl umístěn na mikročipu v roce 1997 [3] .

Sestavení mikročipů DNA

Amplifikované fragmenty DNA jsou aplikovány na křemíkové nebo skleněné destičky pomocí mikromanipulátoru, který kovalentně fixuje sondy. V letech 1991-1993 byl navržen jiný přístup, založený na technologii fotolitografie používané v polovodičovém průmyslu. Později, v roce 1997, byla patentována další metoda – „elektrofokusování“ [2] .


Fotolitografie

Montáž začíná nanesením speciální ochranné fotocitlivé vrstvy na skleněnou desku o rozměrech 12,8 × 12,8 mm, díky níž je samotná deska inertní. Pouze ta místa, kde bude ochranná vrstva osvětlena, jsou schopna připojit deoxyribonukleotidy (A, T, G, C). Po vystavení světlu se na desku nanese roztok jedné z bází . Všechna ostatní místa jsou chráněna speciální fotolitografickou maskou, takže deoxyrubonukleotidy jsou kovalentně navázány na destičku přesně na správných místech, načež se vše, co se spojit nemohlo, smyje. Samotné nukleotidy jsou chemicky upraveny tak, že na sebe mohou navázat jiný nukleotid pouze při vystavení světlu [7] . Opakovaným opakováním cyklů maska ​​- iluminace - aplikace nukleotidu - mytí tolikrát, kolikrát je potřeba a neustálá výměna masek, lze dosáhnout vytvoření jedinečných sekvencí. Pro vytvoření čipu jsou vyvíjeny různé masky, v souladu s požadavky na výsledné sondy [2] .

Řetězce identické jednořetězcové DNA, uspořádané do čtverce 90x90 um , rostou nukleotid po nukleotidu na povrchu destičky. Každý čtverec nakonec obsahuje miliardy stejných sond. Nyní se fotolitografie používá k vytvoření relativně krátkých sond, ne delších než 100 nukleotidů. Počet vyměněných masek při montáži takového čipu je přitom srovnatelný s délkou sond: například pro sestavení sond o délce 18–25 nukleotidů je potřeba asi 40 masek na čipu. V praxi se velké množství identických DNA mikročipů vyrábí společně na velkém skleněném substrátu [2] .


Elektrofocusing

Sestavení takových mikročipů vyžaduje zejména složité substráty, což jsou v podstatě elektronické čipy, s mnoha výstupy, z nichž každý řídí napětí na určitém místě na desce. Na rozdíl od fotolitografie, kde jsou sondy sestavovány po bázi, jsou zde hotové jednovláknové oligonukleotidy dopravovány na požadovaná místa na destičce působením elektrického pole. Pomocí příslušného výstupu mikročipu se na správném místě na destičce vytvoří kladné napětí. Záporně nabitá jednovláknová DNA se pohybuje směrem k generovanému kladnému náboji a připojuje se na správné místo. Poté je aktivován další výstup mikročipu, který dává kladný náboj jinde na desce, kam je odeslána další sonda. Hustota DNA na takových čipech je mnohem menší než na čipech získaných fotolitografií [8] [2] .

Experiment

Existují tři základní typy mikročipů: pro analýzu genové exprese (GEM-microarray), pro komparativní genomovou hybridizaci (MCGH) a pro detekci jednonukleotidových polymorfismů (SNPM) [9] . Základní protokol lze znázornit následovně [10] :

1. Izolace DNA/RNA

V tomto kroku jsou ze vzorků izolovány buď mRNA (GEM) nebo fragmenty genomové DNA (MCGH, SNPM). Nyní to lze snadno provést pomocí speciálních komerčních sad [10] [11] .

2. Značení DNA/RNA

Tento proces začíná reverzní transkripcí (je-li to nutné). Poté se provede amplifikace cílového fragmentu pomocí polymerázové řetězové reakce . Během procesu PCR jsou do složení fragmentů DNA zahrnuty nukleotidy s fluorescenčními značkami [10] [12] .

3. Hybridizace

Zde jsou fluorescenčně značené amplifikované vzorky použity jako cíle pro hledání komplementárních řetězců na mikročipu, tedy schopných tvořit silné dvojité řetězce - duplexy, podle pravidla komplementarity . Jako příklad lze uvést komplementární sekvence 5'-GCATGCAT-3’a 3’-CGTACGTA-5’. Protože je označen jeden z řetězců vytvořeného duplexu, lze signál z takového duplexu registrovat [10] .

4. Praní

Jakmile je hybridizace dokončena, čip se vyjme z roztoku obsahujícího značené vzorky DNA. Samotný čip se pak podle určitých metod důkladně promyje, za použití různých směsí pufrů, centrifugace a tak dále [10] .

5. Naskenujte

Tento proces zahrnuje použití optických skenovacích sond schopných detekovat fotony z přesně definované vlnové délky. Každé místo na čipu je osvětleno paprskem světla o určité vlnové délce, který aktivuje fluorescenční značku. „Ticho“ mikročipu vytvářejí argonové lasery. Aktivovaná fluorescenční značka emituje foton o trochu delší vlnové délce, který je registrován zařízením. Čím více fotonů zařízení zachytí v jednom světle, tím vyšší je intenzita záře daného bodu, což znamená, že vzniká velké množství duplexů [10] .

6. Analýza dat

Data jsou polem hodnot intenzity záře pro každé konkrétní místo mikročipu. Pomocí matematických metod srovnání je možné spolehlivě určit místa čipu, kde došlo k hybridizaci, a tak zjistit sekvenci DNA/RNA ze vzorku [10] [13] .

Aplikace

Analýza genové exprese

Toto je nejběžnější aplikace DNA microarrays. RNA izolovaná z buněčné kultury podléhá reverzní transkripci , což vede ke značené cDNA. Někdy je vyžadován další transkripční krok z cDNA (pro RNA čipy), aby se vytvořila značená cRNA. Existuje několik různých způsobů, jak označit cílovou molekulu: zahrnutí fluorescenčně značených nukleotidů během syntézy cDNA nebo cRNA, použití nukleotidů modifikovaných biotinem , které jsou následně obarveny fluorescenčně značeným streptavidinem, použití modifikovaných nukleotidů během syntézy. pak lze přidat fluorescenční značku [14] .

Takto značená DNA nebo RNA se hybridizuje na mikročipu a poté se smyje. V každém bodě čipu je detekován fluorescenční signál. V případě biotinylovaných vzorků je DNA microarray po hybridizaci obarvena streptavidinem obsahujícím fluorescenční značky. Fluorescence je excitována laserovým světlem a zaznamenávána zpravidla skenovacím konfokálním mikroskopem [15] .

Analýza vazby transkripčních faktorů

Microarrays se také používají ve spojení s chromatinovou imunoprecipitací k identifikaci vazebných míst transkripčního faktoru ( TF) [16] [17] . Formaldehyd se přidává do extraktu buněčné DNA , což vede k vytvoření kovalentních příčných vazeb mezi DNA a proteiny. Poté je DNA fragmentována. Požadovaný TF je izolován ze směsi pomocí afinitní chromatografie s použitím protilátek nebo značek, které jsou předem vloženy do tohoto TF metodami genetického inženýrství. Po purifikaci je DNA zbavena TF, amplifikována, fluorescenčně značena a použita pro hybridizaci na mikročipu. Tato technika je běžně známá jako „ChIP-chip“ [18] nebo imunoprecipitace chromatin-on-a-chip, ale má omezení kvůli skutečnosti, že TF se mohou vázat daleko od genu, který regulují.

Genotypování

DNA microarrays jsou široce používány k detekci jednonukleotidových polymorfismů (SNP). Existuje několik různých přístupů [15] :

Alelická diskriminace

Krátké sondy (25 nukleotidů pro mikročipy Affymetrix) obsahující všechny varianty SNP ve středu jsou umístěny na mikročipech, protože tato poloha nejvíce ovlivňuje kvalitu hybridizace. Fragmentovaná, amplifikovaná, fluorescenčně značená DNA vzorku je nanesena na mikročip, kde dochází k hybridizaci vzorku a sondy. V místech úplné komplementarity molekul je zaznamenán silný signál [19] .

Analýza "Golden Gate".

Tato metoda je založena na polymerázové řetězové reakci. Molekuly komplementární ke genomové DNA jsou umístěny v roztoku genomové DNA a obsahují různé modifikace SNP na 3'-konci a různé primery na 5'-konci pro následnou PCR , navíc molekulu komplementární k jinému vláknu genomové DNA je přidán na druhou stranu SNP, obsahující na 5' konci další primer pro PCR. Polymeráza se bude syntetizovat pouze z toho primeru, jehož 3'-konec odpovídá SNP. Výsledkem je, že v závislosti na tom, který primer s modifikovaným 3'-koncem je použit pro PCR, je takový SNP ve vzorku pozorován [20] .

Nástavec primeru

Zde jsou sondy vybrány tak, aby pokrývaly celou oblast DNA až po SNP, nezahrnující polymorfismus. Fragmentovaná genomová DNA se hybridizuje s takovým čipem, načež se do roztoku přidají polymeráza a fluorescenčně značené nukleotidy se 4 různými značkami na 3'-konci. Takové nukleotidy mohou být připojeny k existujícímu řetězci polymerázou, ale pak k sobě nemohou připojit další nukleotid. V důsledku toho se sondy rozšíří o jeden nukleotid, což odpovídá SNP [21] .

Vnější nukleotidové skóre

Tato metoda je podobná metodě prodlužování primeru s tím rozdílem, že sondy nejsou umístěny na plochém substrátu, ale na mnoha malých kuličkách. SNP je také rozpoznán podle barvy jednoho kompletního nukleotidového značení [22] .

Omezení

Navzdory výhodám DNA microarrays mají také omezení v jejich aplikaci. Předpokládá se, že intenzita signálu (záře) zaznamenaného na konkrétním místě mikročipu závisí lineárně na množství DNA, která prošla hybridizací, což není vždy případ: v důsledku kinetiky hybridizace je úroveň získaného signálu v daném bodě není lineární funkcí koncentrace dané DNA ve vzorku. Je tedy možné přesně odhadnout množství DNA ve vzorku pouze v určitém rozmezí počátečních koncentrací DNA, které stále mohou poskytovat lineární vztah. Odhad relativně zpočátku velkých nebo malých koncentrací vzorku DNA bude nepřesný [15] .

V komplexních genomech eukaryot, zejména savců, existuje mnoho homologních genů, jejichž sekvence jsou velmi podobné, což klade další podmínky pro návrh sond pro mikročipy [23] [24] . Sonda určená pro jeden gen A dokáže „chytit“ i geny B, C, D, které se ukázaly být homologní s genem A, což zkreslí výsledný obraz.

Další omezení souvisí s velikostí databáze známých genů. Je nemožné syntetizovat sondu odpovídající neznámému genu a nelze detekovat žádné interakce takových genů. Tento problém je zvláště důležitý pro prokaryota, protože genomy i blízce příbuzných organismů se mohou výrazně lišit. Například u bakteriálního druhu Aggregatibacter actinomycetemcomitans se genomy různých kmenů mohou lišit o 20 % genů, a proto mikročipy navržené pro jeden kmen nebudou schopny detekovat jiný [25] .

Viz také

Poznámky

  1. ↑ Javier Garaizar, Aitor Rementeria, Steffen Porwollik. Technologie DNA microarray: nový nástroj pro epidemiologickou typizaci bakteriálních patogenů?  // FEMS imunologie a lékařská mikrobiologie. - 2006-07-01. - T. 47 , č.p. 2 . - S. 178-189 . — ISSN 0928-8244 . - doi : 10.1111/j.1574-695X.2006.00081.x . Archivováno z originálu 20. dubna 2017.
  2. ↑ 1 2 3 4 5 M. Bednář. Technologie a aplikace DNA microarray  // Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. - 2000-07-01. - T. 6 , ne. 4 . - S. 796-800 . — ISSN 1234-1010 . Archivováno z originálu 3. dubna 2017.
  3. ↑ 1 2 Lashkari DA, DeRisi JL, McCusker JH, Namath AF, Gentile C., Hwang SY, Brown PO, Davis RW Kvasinkové mikročipy pro genomovou širokou paralelní genetickou analýzu a analýzu genové exprese  //  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Státy americké  : časopis. - 1997. - Sv. 94 . - S. 13057-13062 . - doi : 10.1073/pnas.94.24.13057 . — PMID 9371799 .
  4. ↑ B. Alberts. Molekulární biologie buňky: ve 3 svazcích - 2013. - S. 881-885. - 2821 s. - ISBN 978-0-8153-4111-6 . - ISBN 978-5-4344-0137-1 .
  5. ↑ Kulesh DA, Clive DR, Zarlenga DS, Greene JJ Identifikace interferonem modulovaných sekvencí cDNA souvisejících s proliferací  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America  : journal  . - 1987. - Sv. 84 . - S. 8453-8457 . - doi : 10.1073/pnas.84.23.8453 . — PMID 2446323 .
  6. ↑ Schena M., Shalon D., Davis RW, Brown PO Kvantitativní sledování vzorců genové exprese pomocí komplementárního DNA mikročipu  //  Science : journal. - 1995. - Sv. 270 . - str. 467-470 . - doi : 10.1126/science.270.5235.467 . — PMID 7569999 .
  7. ↑ G. McGall, J. Labadie, P. Brock, G. Wallraff, T. Nguyen. Světlem řízená syntéza oligonukleotidových polí s vysokou hustotou pomocí polovodičových fotorezistů  // Proceedings of the National Academy of Sciences  . - Národní akademie věd Spojených států , 1996-11-26. — Sv. 93 , iss. 24 . - S. 13555-13560 . — ISSN 0027-8424 . Archivováno z originálu 20. dubna 2017.
  8. ↑ CF Edman, DE Raymond, DJ Wu, E. Tu, RG Sosnowski. Hybridizace nukleových kyselin řízená elektrickým polem na mikročipech  // Nucleic Acids Research. — 15. 12. 1997. - T. 25 , č.p. 24 . - S. 4907-4914 . — ISSN 0305-1048 . Archivováno z originálu 20. dubna 2017.
  9. ↑ Národní centrum pro biotechnologické informace. MICROARRAYS: ODŠTĚPOVÁNÍ ZA ZÁJMY VĚDY A MEDICÍNY . Získáno 12. dubna 2017. Archivováno z originálu 13. dubna 2017.
  10. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Dan Tulpan. Nedávné patenty a výzvy v oblasti technologií návrhu DNA mikročipů  // Nedávné patenty na DNA a genové sekvence. — 2010-11-01. - T. 4 , ne. 3 . - S. 210-217 . — ISSN 2212-3431 . Archivováno z originálu 18. dubna 2017.
  11. ↑ Siun Chee Tan, Beow Chin Yiap. Extrakce DNA, RNA a proteinů: minulost a současnost  // Journal of Biomedicine & Biotechnology. — 2009-01-01. - T. 2009 . - S. 574398 . — ISSN 1110-7251 . - doi : 10.1155/2009/574398 . Archivováno z originálu 24. dubna 2017.
  12. ↑ Hagar Zohar, Susan J. Muller. Značení DNA pro experimenty s jednou molekulou: metody značení vnitřních specifických sekvencí na dvouvláknové DNA  // Nanoscale. — 2011-08-01. - T. 3 , ne. 8 . - S. 3027-3039 . — ISSN 2040-3372 . doi : 10.1039 / c1nr10280j . Archivováno z originálu 24. dubna 2017.
  13. ↑ Marco Wiltgen, Gernot P. Tilz. Analýza DNA microarray: principy a klinický dopad  // Hematologie (Amsterdam, Nizozemsko). - 2007-08-01. - T. 12 , č.p. 4 . - S. 271-287 . — ISSN 1607-8454 . - doi : 10.1080/10245330701283967 . Archivováno z originálu 24. dubna 2017.
  14. ↑ pubmeddev. Porovnání metod značení fluorescenční značky DNA používaných pro expresi - PubMed - NCBI  . www.ncbi.nlm.nih.gov. Datum přístupu: 13. dubna 2017.
  15. ↑ 1 2 3 Roger Bumgarner. Přehled DNA mikročipů: typy, aplikace a jejich budoucnost  //  Současné protokoly v molekulární biologii. — 2013-01-01. — Sv. kapitola 22 . — P. Jednotka 22.1. . — ISSN 1934-3647 . - doi : 10.1002/0471142727.mb2201s101 . Archivováno z originálu 19. dubna 2017.
  16. ↑ M. J. Solomon, P. L. Larsen, A. Varshavsky. Mapování interakcí protein-DNA in vivo s formaldehydem: důkaz, že histon H4 je zachován na vysoce transkribovaném  genu  // Buňka . - Cell Press , 1988-06-17. — Sv. 53 , iss. 6 . - S. 937-947 . — ISSN 0092-8674 .
  17. ↑ Christine E. Horak, Michael Snyder. ChIP-čip: genomický přístup k identifikaci vazebných míst transkripčního faktoru  // Methods in Enzymology. - 2002-01-01. - T. 350 . - S. 469-483 . — ISSN 0076-6879 .
  18. ↑ Michael J. Buck, Jason D. Lieb. ChIP-čip: úvahy pro návrh, analýzu a aplikaci experimentů s imunoprecipitací chromatinu v celém genomu  // Genomics . - Academic Press , 2004-03-01. - T. 83 , č.p. 3 . - S. 349-360 . — ISSN 0888-7543 .
  19. ↑ DG Wang, JB Fan, CJ Siao, A. Berno, P. Young. Rozsáhlá identifikace, mapování a genotypizace jednonukleotidových polymorfismů v lidském genomu  // Science (New York, NY). — 15. 5. 1998. - T. 280 , č.p. 5366 . - S. 1077-1082 . — ISSN 0036-8075 . Archivováno z originálu 19. dubna 2017.
  20. ↑ JB Fan, A. Oliphant, R. Shen, BG Kermani, F. Garcia. Vysoce paralelní genotypování SNP  // Symposia Cold Spring Harbor o kvantitativní biologii. - 2003-01-01. - T. 68 . - S. 69-78 . — ISSN 0091-7451 . Archivováno z originálu 19. dubna 2017.
  21. ↑ A. Kurg, N. Tõnisson, I. Georgiou, J. Shumaker, J. Tollett. Prodlužování uspořádaných primerů: technologie čtyřbarevného resekvenování DNA a detekce mutací na pevné fázi  // Genetické testování. — 2000-01-01. - T. 4 , ne. 1 . - S. 1-7 . — ISSN 1090-6576 . - doi : 10.1089/109065700316408 . Archivováno z originálu 19. dubna 2017.
  22. ↑ Kevin L. Gunderson, Frank J. Steemers, Hongi Ren, Pauline Ng, Lixin Zhou. Genotypizace celého genomu  // Enzymologické metody. - 2006-01-01. - T. 410 . - S. 359-376 . — ISSN 0076-6879 . - doi : 10.1016/S0076-6879(06)10017-8 .
  23. ↑ Paul J. Gardina, Tyson A. Clark, Brian Shimada, Michelle K. Staples, Qing Yang. Alternativní sestřih a diferenciální genová exprese u rakoviny tlustého střeva detekovaná celou řadou exonů genomu  // BMC genomika. — 27. 12. 2006. - T. 7 . - S. 325 . — ISSN 1471-2164 . - doi : 10.1186/1471-2164-7-325 . Archivováno z originálu 23. dubna 2017.
  24. ↑ John Castle, Phil Garrett-Engele, Christopher D. Armour, Sven J. Duenwald, Patrick M. Loerch. Optimalizace oligonukleotidových polí a protokolů amplifikace RNA pro analýzu struktury transkriptu a alternativního sestřihu  //  BioMed Central. - 2003-01-01. — Sv. 4 , iss. 10 . — P.R66 . — ISSN 1474-760X . - doi : 10.1186/cz-2003-4-10-r66 . Archivováno z originálu 23. dubna 2017.
  25. ↑ Weerayuth Kittichotirat, Roger E. Bumgarner, Sirkka Asikainen, Casey Chen. Identifikace pangenomu a jeho složek u 14 odlišných kmenů Aggregatibacter aktinomycetemcomitans komparativní genomickou analýzou  // PloS One. — 01.01.2011. - T. 6 , ne. 7 . — S. e22420 . — ISSN 1932-6203 . - doi : 10.1371/journal.pone.0022420 . Archivováno z originálu 23. dubna 2017.
  Přejděte na položku Wikidata  Slovníky a encyklopedie
V bibliografických katalozích