Kvantitativní analýza nukleových kyselin

Aktuální verze stránky ještě nebyla zkontrolována zkušenými přispěvateli a může se výrazně lišit od verze recenzované 22. října 2017; kontroly vyžadují 9 úprav .

Kvantitativní analýza nukleových kyselin  - stanovení koncentrace DNA nebo RNA ve směsi nebo čistém přípravku. Reakce zahrnující nukleové kyseliny často vyžadují přesné informace o množství a čistotě léčiva. Ke stanovení koncentrace nukleové kyseliny v roztoku se používá spektrofotometrická metoda a UV fluorescence, pokud nukleová kyselina obsahuje barvivo.

Spektrofotometrická analýza

Nukleové kyseliny určitým způsobem absorbují ultrafialové světlo . Ve spektrofotometrech je vzorek vystaven ultrafialovému světlu o vlnové délce 260 nm a fotodetektor měří množství světla, které prošlo vzorkem. Čím více světla absorbuje, tím vyšší je koncentrace nukleové kyseliny ve vzorku.

Pomocí Bouguer-Lambert-Beerova zákona je možné korelovat koncentraci molekul absorbujících záření s množstvím absorbovaného světla. Při vlnové délce 260 nm je průměrný extinkční koeficient pro dvouvláknovou DNA 0,020 (μg/ml) −1 cm −1 , pro jednovláknovou DNA 0,027 (μg/ml) −1 cm −1 , pro jednovláknovou RNA 0,025 (μg/ml) −1 cm −1 a u krátkých jednořetězcových oligonukleotidů závisí extinkční koeficient na délce a poměru dusíkatých bází (asi 0,030 (μg/ml) −1 cm −1 ). Optická hustota ( angl.  OD, optická hustota ) rovná 1 tedy odpovídá koncentraci dvouvláknové DNA přibližně 50 ug/ml. Spektrofotometrická metoda pro stanovení koncentrace nukleových kyselin se používá při koncentracích do 2 OD. [1] K určení koncentrace oligonukleotidů jsou zapotřebí přesnější extinkční koeficienty, které lze předpovědět pomocí modelu nejbližšího souseda. [2]

Konverzní kurzy

Typ nukleové kyseliny Koncentrace (ug/ml) pro 1 jednotku A 260
dsDNA (dvouvláknová DNA) padesáti
ssDNA (jednovláknová DNA) 37
ssRNA (jednovláknová RNA) 40

Kyvety pro analýzu

Pro stanovení koncentrace vzorku je třeba optickou hustotu zjištěnou ve standardní kyvetě s optickou dráhou 10 mm vynásobit příslušným koeficientem. Například hodnota absorbance 0,9 optických jednotek dvouvláknové DNA odpovídá koncentraci 45 μg/ml.

Maloobjemové kyvety

Mnoho biologických studií ( DNA microarray , kvantitativní PCR ) vyžaduje kvalitativní a kvantitativní stanovení malých objemů nukleových kyselin. Speciální nanofotometry [3] umožňují stanovit koncentraci vzorků bez pomoci kyvety v submikrolitrových objemech již od 0,3 μl. Protože se měření provádějí na neředěném vzorku, reprodukovatelnost výsledků je velmi vysoká a vzorky samotné lze po analýze použít.

Čistota vzorku

Vzorky nukleových kyselin často obsahují nečistoty proteinů a jiných organických látek. Poměr absorbance při 260 a 280 nm ( A260 /280 ) se často používá k hodnocení čistoty přípravku. Čistá DNA má poměr A 260/280 asi 1,8, vzorek RNA bez nečistot A 260/280 asi 2.

Proteinové nečistoty a poměr 260:280

Pro detekci proteinových nečistot v roztocích nukleových kyselin analyzujte absorpční poměr roztoků při vlnových délkách 260 a 280 nm, protože aromatické aminokyseliny v proteinech absorbují při 280 nm [1] [4] . Vliv proteinů nečistot na stanovení koncentrace nukleových kyselin je však malý - pouze při významné koncentraci proteinu se poměr 260:280 výrazně posouvá [1] [5] .

Poměr 260:280 umožňuje stanovit příměs nukleových kyselin v roztocích bílkovin a příměs bílkovin v roztocích nukleových kyselin:

% veverka % nukleová kyselina poměr 260:280
100 0 0,57
95 5 1.06
90 deset 1.32
70 třicet 1,73

Poměr 260:230 je méně citlivý při stanovení proteinových nečistot v roztoku nukleové kyseliny:

% nukleová kyselina % veverka poměr 260:230
100 0 2,00
95 5 1,99
90 deset 1,98
70 třicet 1,94

Tyto rozdíly jsou způsobeny vyšší hodnotou molárního extinkčního koeficientu nukleových kyselin při vlnových délkách 260 a 280 nm ve srovnání s proteiny. Proto i pro proteinový roztok o relativně vysoké koncentraci je příspěvek k absorpci při vlnových délkách 260 a 280 nm malý. Kontaminaci proteinů v roztoku nukleové kyseliny nelze určit poměrem 260:230.

Jiné znečištění
  • Kontaminace fenolem, který se často používá při izolaci nukleových kyselin, může vést k významným chybám v měření koncentrace nukleových kyselin. Fenol má maximální absorpci při 270 nm a poměr A 260/280 asi 1,2. Nukleové kyseliny bez fenolu mají poměr A 260/280 asi 2 [1] . Fenolové nečistoty mohou významně zvýšit koncentraci DNA.
  • Absorpce při 230 nm může být způsobena kontaminací fenoláty , thiokyanáty a dalšími organickými sloučeninami. Pro čistý vzorek RNA by měl být poměr A 260/230 asi 2, pro vzorek čisté DNA A 260/230 asi 1,8. [6]
  • Absorpce při vlnové délce 330 nm a vyšší indikuje jinou kontaminaci roztoku. Absorpce při těchto vlnových délkách pro přípravky čisté nukleové kyseliny by měla být nulová.
  • Záporné hodnoty mohou být způsobeny nesprávným výběrem roztoku použitého jako slepý vzorek (blank) nebo mohou být důsledkem přítomnosti fluorescenčního barviva v roztoku.

Stanovení počtu molekul DNA nebo RNA se specifickými nukleotidovými sekvencemi pomocí technologie SlipChip

Pro diagnostické účely je často nutné určit množství konkrétní DNA nebo RNA. Pro stanovení DNA a RNA v mikroobjemech vzorků - kapkách nepřesahujících několik pikolitrů byly vyvinuty vysoce citlivé metody. K tomu se používají mikrofluidní zařízení pro PCR s jedinou kopií nukleové kyseliny [7] [8] [9] [10] .

Poznámky

  1. ↑ 1 2 3 4 Sambrook a Russell. Molekulární klonování: Laboratorní příručka  (neurčitá) . — 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. - ISBN 978-087969577-4 .
  2. ↑ Tataurov A.V.; You Y., Owczarzy R. Predikce ultrafialového spektra jednovláknových a dvouvláknových deoxyribonukleových kyselin   // Biophys . Chem. : deník. - 2008. - Sv. 133 , č. 1-3 . - str. 66-70 . - doi : 10.1016/j.bpc.2007.12.004 . — PMID 18201813 .
  3. ↑ Kartha, R. Spectrophotometric Quantification of Nano- and Standard-Volume Samples, (2008, 7. října), Americká biotechnologická laboratoř, http://www.iscpubs.com/Media/PublishingTitles/b0608kar.pdf
  4. ↑ Sambrook a Russell citují původní článek: Warburg, O. a Christian W. Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Enolase  (German)  // Biochem. Z. : prodejna. - 1942. - Bd. 310 . - S. 384-421 . )
  5. ↑ Glasel J. Platnost čistoty nukleových kyselin monitorovaná   poměry absorbance 260nm/280nm // BioTechniques : deník. - 1995. - Sv. 18 , č. 1 . - str. 62-63 . — PMID 7702855 . )
  6. ↑ Analýza DNA nebo RNA pomocí jejích vlnových délek: 230 nm, 260 nm, 280 nm . Bioteachnology.com (13. ledna 2010). Získáno 12. března 2010. Archivováno z originálu 6. září 2012.
  7. ↑ Shen, F., Du, W., Kreutz, JE, Fok, A., & Ismagilov, RF (2010). Digitální PCR na čipu SlipChip ]. Laboratoř na čipu, 10(20), 2666-2672. doi : 10.1039/c004521g PMC 2948063
  8. ↑ Jesus Rodriguez-Manzano, Michail A. Karymov, Stefano Begolo, David A. Selck, Dmitriy V. Žukov, Erik Jue, Rustem F. Ismagilov. Odečítání jednomolekulární digitální izotermické amplifikace RNA a DNA v nanolitrových objemech pomocí neupravených telefonů s fotoaparátem Archivováno 10. května 2017 na Wayback Machine . ACS Nano, 2016; doi : 10.1021/acsnano.5b0733
  9. ↑ Ahrberg, CD, Ilic, BR, Manz, A., & Neužil, P. (2016). Ruční zařízení PCR v reálném čase. Archivováno 4. května 2016 v Wayback Machine Lab on a Chip., 16, 586-592 doi : 10.1039/C5LC01415H PMID 26753557 PMC 4773913 Dostupné dne 26.01.2017
  10. ↑ Zhao Li, Yong Liu, Qingquan Wei, Yuanjie Liu, Wenwen Liu, Xuelian Zhang a Yude Yu1 (2016). Digitální rekombinázová polymerázová amplifikace pro absolutní kvantifikaci nukleových kyselin na bázi pikolitrových čipů . PLOS One.; 11(4): e0153359 doi : 10.1371/journal.pone.0153359 PMC 4830604