Mad2 (mitotický deficitní blokátor 2) je důležitý protein kontrolního bodu vřetena . Systém kontrolních bodů vřetena je regulační systém, který brání progresi přechodu z metafáze do anafáze . Gen Mad2 byl poprvé identifikován v kvasinkách S. cerevisiae ve screeningu genů zmutovaných tak, aby byly citlivé na mikrotubulové jedy [1] . Lidské ortology Mad2 ( MAD2L1 a MAD2L2 byly poprvé izolovány při hledání lidské cDNA , která zachránila mikrotubuly kvasinkového kmene citlivého na jedy, který postrádal protein vázající kinetochory [2] . Bylo prokázáno, že protein je přítomen v osamocených kinetochorech a studie inhibice protilátek ukázala, že je zásadní pro blokování přechodu z metafáze do anafáze v reakci na otravu mikrotubulů nokodazolem.2 Od izolace ortologu Xenopus laevis podobného lidským sekvencím bylo možné charakterizovat mitotický kontrolní bod ve vaječných extraktech . .3
Progrese z metafáze do anafáze je poznamenána oddělením sesterských chromatid . Mechanismus sledování buněčného cyklu , který brání sesterským chromatidám v separaci a vstupu do anafáze, se nazývá kontrolní bod vřetena. Jako opatření proti chromozomovým chybám zpožďuje kontrolní bod sestavení vřetena (SAC) anafázi, dokud nebudou všechny páry sesterských chromatid připojeny bipolární.
Jakmile jsou mikrotubuly připojeny ke kinetochorům , chromozomy se zarovnají na metafázové desce a je dosaženo biorientace, mechanismus zastavení SAC je odstraněn. Vstup do anafáze je zprostředkován aktivací APCCdc20. APCCdc20 je ubikvitinová proteinová ligáza, která označuje protein, securin, pro destrukci. Zničení securinu uvolňuje a aktivuje separázu. Securin vázaná separáza zůstává blokována; když se však inhibice uvolní, aktivovaná separáza štěpí kohezinový komplex, který k sobě váže sesterské chromatidy [5] .
Bez Cdc20 nelze aktivovat anafázový stimulační komplex (APC) a anafáze nenastane. Bylo prokázáno, že Mad2 inhibuje aktivitu APC přímou fyzickou interakcí [6] v ternárním komplexu s Cdc20 [7] . Kinetochory, ke kterým zůstávají připojeny mikrotubuly, katalyzují sekvestraci Cdc20 pomocí Mad2. Když jsou savčí buňky ošetřeny vřetenovým depolymerizačním činidlem nokodazolem v metafázi , proteiny MAD2 se stanou lokalizovány do kinetochorů všemi páry sesterských chromatid [5] .
Mad2 je schopen tvořit multimery a přijímá alespoň dvě strukturální konformace . Otevřený Mad2 se liší od uzavřeného Mad2 v umístění 50 zbytků C-terminálního segmentu. Tento "bezpečnostní pás" byl pevně přitlačen k pravé straně proteinu v otevřené konformaci. Po uvolnění může bezpečnostní pás znovu nainstalovat vázací partner. V uzavřené konformaci se svazek ovine kolem navázaného ligandu a interaguje s jinou oblastí Mad2. Vazebnými partnery Mad2 mohou být buď Cdc20 nebo Mad1. Mad1 a Cdc20 vážou Mad2 stejným způsobem. Mad2 používá stejné místo k navázání buď Mad1 nebo Cdc20, a tak může vázat pouze jeden ze dvou proteinů najednou [5] .
Vzhledem k tomu, že osamělé kinetochory vytvářejí a udržují SAC, je rekrutován Mad2, aby zabránil separaci těchto neuspořádaných sesterských chromatid . Když je proces inhibice kontrolního bodu aktivován, Mad2 váže Mad1 a vytváří uzavřený komplex Mad2-Mad1. Vzhledem k tomu, že Mad1:Mad2 je stabilní komplex a jak CDC20, tak MAD1 vážou Mad2 na stejném vazebném místě, je vysoce nepravděpodobné, že by uzavřený Mad2 uvolnil Mad1 k navázání na Cdc20.
Model vysvětlující Mad2 konformaci schopnou vázat se na Cdc20 spoléhá na primární tvorbu komplexu jádra Mad1-Mad2. V tomto modelu je externí otevřený Mad2 rekrutován do matice Mad1:Mad2. Tato interakce Mad2:Mad2 je nezbytná k vyřešení konformačních změn, které umožňují interakci otevřené periferie vázané na Mad2 s Cdc20. Cdc20:Mad2 je pak degradován a Mad1:Mad2 může opět vázat volný cytosolický Mad2 [8] .
Předpokládá se, že jakmile se vytvoří komplexy Cdc20:Mad2, mohou zesílit nevyřízený signál anafáze , stimulovat další konverzi cytosolického otevřeného Mad2 a volného Cdc20 na Cdc20: uzavřený komplex Mad2. Tato difúze šíření signálu z kinetochorových komplexů může vysvětlovat, jak může prázdné místo pouze jednoho malého kinetochorového místa zcela uzavřít přechod z metafáze do anafáze [9] .
Zbývá ještě mnoho vysvětlit o signalizaci kontrolních bodů vřetena a příspěvku dalších proteinů sestavujících kontrolní bod vřetena, jako jsou Bub1 , BubR1 a Bub3 . BubR1 a Bub3 mohou také vytvořit komplex Cdc20, ale to se ještě uvidí, zda tyto proteiny usnadňují vazbu Cdc20 k otevření Mad2 [9] .
Je také velmi nejasné, jak p31comet působí proti kontrolnímu bodu a podporuje disociaci Mad2-Cdc20. De Antoni et al. navrhují, že v kombinaci s "Matrix Mad2", p31comet soutěží s otevřeným Mad2 o vazbu na uzavřený Mad2: Mad1. Probíhá testování, aby objasnilo, jak může p31comet umlčet kontrolní body vřetena [10] .