Klonování bez ligace ( LIC , Ligation Independent Cloning ), v genetickém inženýrství , je metoda pro získání plazmidů, která nevyužívá restrikční a ligační reakce.
Technologie bezligázového klonování zkracuje čas pro vytvoření nových genetických konstruktů, například pro expresi rekombinantního proteinu , a je nejvhodnější pro vysoce výkonnou výrobní linku proteinů. Pro klonování bez ligace je nutné připravit LIC vektor - linearizovanou sekvenci DNA se specifickými lepivými konci o délce 11-14 nukleotidů . Za tímto účelem je molekula vektoru hydrolyzována restrikčním enzymem na jednom místě a poté ošetřena T4 fágovou DNA polymerázou v přítomnosti jednoho z nukleotidů. Aktivita 3'-exonukleázy tohoto enzymu vede k odstranění nukleotidů z 3'-konce, dokud se nukleotid přítomný v reakční směsi nenajde v sekvenci (viz obrázek). Molekula vektoru je speciálně připravena tak, aby se tento nukleotid nevyskytoval na obou stranách restrikčního místa pro 11-14 jednotek. Jakmile byl LIC vektor izolován, může být uložen a znovu použit ke klonování genů cílového proteinu do něj. Primery pro PCR těchto genů se volí tak, aby byly na jedné straně komplementární k začátku nebo konci cílového genu a na druhé straně k lepivým oblastem vektoru LIC. Poté se po PCR získá proteinový gen, ve kterém jsou na obou stranách jednořetězcové sekvence dlouhé 11-14 nukleotidů, komplementární k vektoru. Stačí smíchat takový produkt s vektorem a směsí transformovat kompetentní bakteriální buňky, aby se získaly plazmidy s proteinovým genem. Klonování bez ligace se tedy vyhýbá několika krokům restrikce, gelování a ligace, které všechny mohou způsobit selhání klonování.
1. De Jong, R. Enzyme Free Cloning pro vysoce výkonné klonování genů a expresi / R. de Jong, M. Daniels, R. Kaptein a G. Folkers // J. Struct. Funct. Genomika. - 2006. - V. 7. - S. 109–118.
2. Lee, J. Vysoce výkonný T7 LIC vektor pro zavedení C-koncových polyhistidinových značek s proměnnými délkami bez dalších sekvencí / J. Lee a S. Kim // Prot. Expr. Purif. - 2009. - V. 63. - S. 58–61.
3. Nový, R. Ligation Independent Cloning: Efficient Directional Cloning of PCR Products / R. Nový, K. Yaeger a K. Kolb // Innovations. - 1997. - V. 5. - S. 1-3.
4. Bardóczy, V. Sada in vitro translačních vektorů pro produkci eukaryotických proteinů nezávislých na ligaci / V. Bardóczy, V. Géczi, T. Sawasaki, Y. Endo a T. Mészáros // BMC Biotechnology. - 2008. - V. 8. - č. 32. - S. 1-7.