Iontové polovodičové sekvenování ( angl. Ion Semiconductor Sequencing ) je metoda pro stanovení sekvence DNA založená na detekci vodíkových iontů , které se uvolňují při polymeraci DNA. Toto je technika "sekvenování při syntéze", ve které je komplementární řetězec konstruován ze sekvence templátového řetězce.
Mikrojamky obsahující templátovou molekulu DNA, která má být sekvenována, jsou naplněny jedním typem deoxyribonukleotidtrifosfátu (dNTP). Pokud je zavedený dNTP komplementární k vedoucímu nukleotidu templátu, je zahrnut do rostoucího komplementárního vlákna. To způsobí uvolnění vodíkových iontů, které spustí ISFET iontový senzor , který indikuje, že došlo k reakci. Pokud je v sekvenci templátového řetězce přítomna repetice jednoho nukleotidu, bude v jednom cyklu připojeno několik molekul dNTP. To vede ke zvýšení počtu vytvořených vodíkových iontů a úměrně vyššímu elektrickému signálu.
Tato technologie se od ostatních sekvenačních technologií liší tím, že nepoužívá modifikované nukleotidy a optické senzory. Iontové polovodičové sekvenování může být také označováno jako iontové torrentové sekvenování, pH zprostředkované sekvenování nebo polovodičové sekvenování. Technologie vyvinutá společností Ion Torrent Systems, Inc, byla licencována od DNA Electronics Ltd, [1] [2] a vydána v únoru 2010. [3] Ion Torrent umístil své systémy jako rychlé, kompaktní a ekonomické sekvencery vhodné pro mnoho laboratoří jako profesionální systémy. [4] Roche's 454 Life Sciences spolupracuje s DNA Electronics na vývoji kompaktní platformy pro čtení dlouhých sekvencí DNA využívající tuto technologii. [5]
K inkorporaci deoxyribonukleotidtrifosfátu (dNTP) do rostoucího řetězce DNA dochází za vzniku kovalentní vazby a uvolnění pyrofosfátu a kladně nabitého vodíkového iontu. [1] [3] [6] dNTP bude zahrnut pouze v případě, že je komplementární k vedoucímu nepárovému nukleotidu templátového řetězce. Sekvenování iontových polovodičů je založeno na skutečnosti, že když je jeden typ dNTP nahrazen jiným, uvolňuje se vodíkový iont.
Nemodifikované A, C, G nebo T dNTP jsou postupně zaplaveny do každé mikrojamky na polovodičovém čipu obsahujícím jednu molekulu templátu jednovláknové DNA, která má být sekvenována, a DNA polymerázu . [3] [7] [8] Pokud je zavedený dNTP komplementární k dalšímu nepárovému nukleotidu na templátovém řetězci, je začleněn do rostoucího komplementárního řetězce DNA polymerázou. [9] Pokud zavedený dNTP není komplementární, k polymerační reakci nedochází. Vodíkový iont, který se uvolňuje při reakci, mění pH roztoku, což je detekováno ISFET . [1] [3] [7] Nezreagované molekuly dNTP jsou vymyty před dalším cyklem, kdy jsou zavedeny jiné druhy dNTP. [7]
Senzory ISFET jsou umístěny pod iontově citlivou vrstvou mikrojamek . [4] Všechny vrstvy jsou umístěny na čipu CMOS, podobném těm, které se hojně používají v elektronickém průmyslu. [4] [10]
Každý čip obsahuje pole mikrojamek s odpovídajícími ISFET senzory. [7] Každý emitovaný vodíkový ion spouští senzor ISFET . Série elektrických impulsů přenášených z čipu do počítače je převedena na sekvenci DNA bez přechodné konverze signálu, [7] [11] protože elektronika přímo registruje události nukleotidových inkluzí v řetězci, bez použití značených nukleotidů a optických Měření. [4] [10] Zpracování signálu a sestavení sekvence DNA lze provést softwarově.
Přesnost sekvenování iontových polovodičů k únoru 2011 byla 99,6 % s 50nukleotidovým fragmentem (čteno), 100 Mb na průchod. [12] K únoru 2011 byla délka sekvenovaných fragmentů 100 párů bází. [12] Přesnost čtení opakování dlouhých 5 nukleotidů byla 98 %. [12] Tyto údaje dosud nebyly nezávisle ověřeny mimo společnost.
Hlavními výhodami sekvenování iontových polovodičů jsou vysoká rychlost sekvenování s nízkými počátečními investičními a provozními náklady. [8] [11] To bylo možné díky absenci modifikovaných nukleotidů a optických měření.
Protože systém zaznamenává události přidání nukleotidů vytvořených přírodní polymerázou, sekvenování může probíhat v reálném čase. Ve skutečnosti je rychlost sekvenování omezena rychlostí změny nukleotidového substrátu . [13] Ion Torrent Systems, vývojář technologie, tvrdí, že měření (fixace) každého přidání nukleotidu trvá 4 sekundy a každý běh trvá asi hodinu, během které je sekvenována sekvence 100-200 nukleotidů. [11] [14] Pokrok v oblasti polovodičových čipů (předpovězený Moorovým zákonem ) naznačuje, že počet čtení na čip (a tedy na běh) by se měl zvýšit. [jedenáct]
Pořizovací cena sekvenátoru zprostředkovaného pH od společnosti Ion Torrent Systems, Inc při uvedení na trh byla asi 50 000 USD, nezahrnuje zařízení pro přípravu vzorků a server pro analýzu dat. [8] [11] [14] Cena za běh je také výrazně nižší než u alternativních metod automatizovaného sekvenování a pohybuje se kolem 1 000 $. [8] [12]
Pokud je na templátovém řetězci (který má být sekvenován) přítomen homopolymer sestávající z repetic stejného nukleotidu (např. GGGGG) , je připojeno několik nukleotidů najednou a v jednom cyklu se vytvoří více vodíkových iontů. To má za následek větší změnu pH a úměrně vyšší elektronický signál. [11] Omezení tohoto systému spočívá v tom, že je obtížné vypočítat délku opakování. Toto omezení je sdíleno jinými metodami, které detekují inzerce jednotlivých nukleotidů, jako je pyrosekvenování . [15] Signály generované dlouhou repeticí je obtížné odlišit od podobných signálů jiných délek, například repetice dlouhá 7 nukleotidů je obtížné odlišit od homo repetice dlouhé 8 nukleotidů.
Byla zde také významná přítomnost chyb v sekvenování ve formě jednonukleotidových inzercí a delecí, obvykle v heterozygotním stavu. K vyřešení tohoto problému vydala společnost Life Technologies aktualizaci softwarového produktu Ion Reporter.
Další nevýhodou tohoto systému je krátká délka čtení ve srovnání s jinými metodami sekvenování, jako je Sangerovo sekvenování nebo pyrosekvenování . Velké délky čtených fragmentů jsou užitečné pro de novo sestavení genomu . K dnešnímu dni je délka čtení dosažená společností Ion Torrent Systems, Inc. 600 párů bází na jeden průchod. [3] [8] V současnosti je propustnost nižší než u jiných vysoce výkonných sekvenačních technologií, ačkoli vývojáři doufají, že to změní zvýšením hustoty mikrojamek na čip . [3] V roce 2018 byla vydána nová řada sekvenátorů Ion GeneStudio S5, která je výkonem srovnatelná s ostatními technologiemi sekvenování celého genomu, přičemž je překonává v rychlosti.
Iontové polovodičové sekvenování je na trhu umístěno jako rychlý, kompaktní a ekonomický sekvenační stroj, který lze použít ve velkém počtu laboratoří jako špičkový stroj. [3] [4] Společnost doufá, že jejich systém najde uplatnění nejen ve specializovaných centrech, ale také v nemocnicích, malých univerzitních a průmyslových laboratořích. Článek New York Times z ledna 2011 s názvem „Taking DNA Sequencing to the Masses“ tuto ambici zdůrazňuje. [16]
Vzhledem k tomu , že alternativní metody sekvenování jsou schopny dosáhnout delších čtených délek (a jsou tedy vhodnější pro analýzu celého genomu ), může být tato technologie nejvhodnější pro aplikace v malém měřítku, jako je sekvenování mikrobiálního genomu, sekvenování mikrobiálního transkriptomu , cílové sekvenování, sekvenování amplikonu nebo pro kontroly kvality sekvenování knihoven. [3] [8]