Sangerova metoda je metoda sekvenování DNA , známá také jako metoda ukončení řetězce. Tuto metodu sekvenování poprvé navrhl Frederick Sanger v roce 1977 [1] , za což mu byla v roce 1980 udělena Nobelova cena za chemii . Tato metoda je nejrozšířenější již 40 let.
V klasické verzi Sangerovy metody působí jedno z vláken analyzované DNA jako templát pro syntézu komplementárního vlákna enzymem DNA polymerázou . Reakce se stejnou matricí se provádí ve čtyřech různých zkumavkách, z nichž každá obsahuje:
Dideoxyribonukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP nebo ddTTP) postrádají 3'-hydroxylovou skupinu, takže další syntéza je po jejich zařazení do řetězce přerušena. V každé zkumavce tak vznikne sada různě dlouhých fragmentů DNA, které končí stejným nukleotidem (podle přidaného dideoxynukleotidu). Po dokončení reakce se obsah zkumavek oddělí elektroforézou na polyakrylamidovém gelu za denaturačních podmínek a gely se autoradiografují . Produkty čtyř reakcí tvoří „sekvenační žebříček“, který umožňuje „přečíst“ nukleotidovou sekvenci fragmentu DNA [2] [1] .
Sangerova metoda také umožňuje určit nukleotidovou sekvenci RNA , ale ta musí být nejprve "přepsána" ve formě DNA pomocí reverzní transkripce .
K dnešnímu dni je sekvenování DNA podle Sangera plně automatizované a provádí se na speciálních zařízeních, sekvenátorech. Použití dideoxynukleotidů s fluorescenčními značkami s různými emisními vlnovými délkami umožňuje provést reakci v jedné zkumavce. Reakční směs je separována kapilární elektroforézou v roztoku, fragmenty DNA vystupující z kapilární kolony jsou zaznamenávány fluorescenčním detektorem . Výsledky jsou analyzovány počítačem a prezentovány jako sekvence barevných píku odpovídajících čtyřem nukleotidům. Sekvenátory tohoto typu mohou "číst" v čase sekvence o délce 500-1000 nukleotidů. Pro srovnání, metoda pyrosekvenování , vyvinutá v roce 1996, umožňuje jedním krokem určit sekvenci mnohem menšího počtu nukleotidů. Automatizace značně urychlila proces sekvenování a umožnila sekvenování celých genomů , včetně lidského genomu [2] .