| Zelený fluorescenční protein | |
|---|---|
| Struktura GFB medúzy Aequorea victoria [1] | |
| Identifikátory | |
| Symbol | ZFB, GFP |
| Pfam | PF01353 |
| klan Pfam | CL0069 |
| Interpro | IPR011584 |
| SCOP | 1ema |
| NADRODINĚ | 1ema |
| Dostupné proteinové struktury | |
| Pfam | struktur |
| PNR | RCSB PNR ; PDBe ; PDBj |
| PDB součet | 3D model |
| Mediální soubory na Wikimedia Commons | |
Zelený fluorescenční protein ( GFP ) je protein izolovaný z medúzy Aequorea victoria , který fluoreskuje v zelené oblasti, když je osvětlen světlem od modré po ultrafialové. V současné době je proteinový gen široce používán jako světelný marker v buněčné a molekulární biologii pro studium exprese buněčných proteinů. Proteinové modifikace byly vyvinuty pro použití v biosenzorech . Byla vytvořena celá světélkující zvířata (například prasata ), u kterých byl ZFB zaveden do genomu a je zděděn. Byly také vytvořeny virové vektory obsahující GFB , které umožňují lokálně zavést požadovaný gen do živočišného organismu a sledovat exprimovaný protein. V roce 2008 obdrželi Osamu Shimomura , Martin Chalfi a Roger Tsien Nobelovu cenu za chemii „za objev a vývoj zeleného fluorescenčního proteinu GFP“.
Zelený fluorescenční protein je charakterizován dvěma absorpčními vrcholy při 395 nm (hlavní) a 475 nm (vedlejší) a fluorescenčním vrcholem při 498 nm. Protein se skládá z 238 aminokyselin s molekulovou hmotností 26,9 kDa. Protein je typická beta-listová struktura (viz například lipokalin ), tvořící „sud“ nebo „válec“ o 11 otáčkách primární sekvence, uvnitř kterého je fluorofor . Plášť válce chrání fluorofor před zhášením jeho fluorescence složkami mikroprostředí. Vnitřní struktura molekuly navíc způsobuje specifické cyklizační reakce tripeptidu Ser 65 - Tyr 66 - Gly 67, což vede ke vzniku fluoroforu. Tento proces se nazývá zrání a zahrnuje několik fází, z nichž každá tvoří meziprodukty nebo konečné produkty s různými spektrálními vlastnostmi.
Krystalová struktura proteinu byla dešifrována v roce 1996 v Remington Laboratory. Objasnila mechanismus vzniku fluoroforů a roli okolních aminokyselin. To umožnilo získat mutantní GFP se zvýšenou odolností, odlišnou fluorescencí a dalšími zlepšenými vlastnostmi ve srovnání s divokým typem.
Zeleně fluorescenční protein byl izolován spolu s dalším světélkujícím proteinem , aequorinem, z medúzy Aequorea victoria Osamu Shimomura , který přišel z Japonska na Princetonskou univerzitu v roce 1960 a začal studovat bioluminiscenci medúzy. V 60. a 70. letech izoloval oba proteiny a studoval mechanismus jejich luminiscence. Ukázalo se, že u A. victoria způsobuje interakce vápenatých iontů s ekvorinem modrou luminiscenci proteinu. Část této bioluminiscence se přenese do zeleného fluorescenčního proteinu, který absorbuje modré světlo a vyzařuje zelenou fluorescenci, což má za následek zelený posun v záři medúzy.
Využití GFP v molekulární biologii však začalo až v 90. letech 20. století. V roce 1992 Douglas Prasher naklonoval a sekvenoval DNA proteinu, načež byl kvůli nedostatku financí nucen projekt uzavřít a výslednou DNA poslal do několika laboratoří, včetně laboratoře Martina Chalfiho . Martin Chalfi vyjádřil sekvenci v Escherichia coli a Caenorhabditis elegans a výsledky publikoval v Science v roce 1994 . O měsíc později byly zveřejněny nezávislé výsledky z laboratoře Fredericka Tsujiho . Ukázalo se, že GFP přijal nativní konformaci a vytvořil fluorofor při pokojové teplotě a bez přidání dalších kofaktorů, což umožnilo použít protein jako marker v buňkách mnoha organismů.
Julian Voss-Andreae, umělec německého původu specializující se na „proteinové sochy“, vytvořil sochy založené na struktuře ZFB, včetně „Green Fluorescent Protein“ (2004) 1,7 m vysoké a „Steel medúzy (2006) 1,4 m vysoké Ten byl instalován na biologické stanici Friday Harbor Laboratories Washingtonské univerzity (University of Washington), kde v roce 1962 Usáma Shimomura objevil ZFB.