Sekvenování

Sekvenování biopolymerů ( proteiny a nukleové kyseliny  - DNA a RNA ) - stanovení jejich aminokyselinové nebo nukleotidové sekvence (z latiny  sequentum  - sekvence). Výsledkem sekvenování je formální popis primární struktury lineární makromolekuly ve formě sekvence monomerů v textové podobě. Velikosti segmentů DNA, které mají být sekvenovány, obvykle nepřesahují 100 párů bází (sekvenování nové generace) a 1000 párů bází pro Sangerovo sekvenování. V důsledku sekvenování překrývajících se úseků DNA se získávají sekvence úseků genů, celých genů , celkové mRNA nebo kompletních genomů organismů [1] [2] .

Pro sekvenování se používají metody Edmana , Sangera a dalších; v současnosti se pro sekvenování genů běžně používá Sangerova metoda s dideoxynukleosidtrifosfáty ( ddNTP Obvykle se před sekvenováním část DNA, která má být sekvenována, amplifikuje pomocí PCR . Sekvenování celého genomu se obvykle provádí pomocí technologií sekvenování nové generace .

Sangerovo sekvenování

Metoda dideoxynukleotidů neboli metoda „ukončení řetězce“ byla vyvinuta F. Sangerem v roce 1977 a v současnosti je široce používána ke stanovení nukleotidové sekvence DNA. Sangerovo sekvenování hybridizuje syntetický oligonukleotid dlouhý 17–20 nt se specifickým místem v jednom z řetězců sekvenovaného místa. Tento oligonukleotid je primer , který poskytuje 3'-hydroxylovou skupinu pro zahájení syntézy řetězce komplementárního k templátu.

Roztok primeru je rozdělen do čtyř zkumavek, z nichž každá obsahuje čtyři deoxynukleotidy, dATP, dCTP, dGTP a dTTP (z nichž jedna je radioaktivně značená) a jeden ze čtyř 2',3'-dideoxynukleotidů (ddATP, ddTTP, ddGTP nebo ddCTP). . Dideoxynukleotid je obsažen na všech pozicích ve směsi rostoucích řetězců a po jeho připojení se růst řetězce okamžitě zastaví.

Výsledkem je, že v každé ze čtyř zkumavek se za účasti DNA polymerázy vytvoří jedinečná sada oligonukleotidů různých délek, včetně sekvence primerů. Dále se do zkumavek přidá formamid k oddělení řetězců a elektroforéza se provádí v polyakrylamidovém gelu ve čtyřech drahách. Proveďte autoradiografii , která vám umožní „číst“ nukleotidovou sekvenci sekvenovaného segmentu DNA.

V modernější verzi jsou dideoxynukleotidy značeny čtyřmi různými fluorescenčními barvivy a PCR se provádí v jedné zkumavce. Poté při elektroforéze na polyakrylamidovém gelu laserový paprsek v určitém bodě gelu vybudí fluorescenci barviv a detektor určí, který nukleotid právě migruje gelem. Moderní přístroje používají pro sekvenování DNA kapilární elektroforézu . [3]

Vysoce efektivní sekvenování

Viz také

• Edmanova metoda
• Bisulfitové sekvenování
• Pyrosekvenování
• Metody sekvenování nové generace
• Jednobuněčné sekvenování DNA

Poznámky

1. ↑ Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. Molekulární biologie buňky: ve třech svazcích. - 2. - Moskva: Mir, 1994. - T. 1. - 517 s. — 10 000 výtisků.  — ISBN 5030019855 .
2. ↑ Knorre D. G., Myzina S. D. Biologická chemie. - 3. - Moskva: Vyšší škola, 2000. - 479 s. - 7000 výtisků.  — ISBN 5060037207 .
3. ↑ Glik B., Pasternak J. Molekulární biotechnologie. Principy a aplikace. - Moskva: Mir, 2002. - 589 s. — ISBN 5030033289 .

Literatura

• Glick B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Principy a aplikace. - Moskva: Mir, 2002. - 589 s. — ISBN 5030033289 .

Odkazy

• Kód života: číst neznamená rozumět
• UniProt.Proteinová sekvence a funkční informace.
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4727787/
• https://www.longdom.org/open-access/generations-of-sequencing-technologies-from-first-to-next-generation-0974-8369-1000395.pdf
• https://www.creative-biogene.com/blog/index.php/2016/11/01/brief-introduction-on-three-generations-of-genome-sequencing-technology/
• https://www.nature.com/articles/nbt1486 (2008)

Slovníky a encyklopedie	Velký Rus