Křenová peroxidáza

Křenová peroxidáza ( HRP ) je enzym  izolovaný z křenu , který se široce používá v technikách molekulární biologie ke zvýšení slabého signálu na úroveň potřebnou pro detekci. Křenová peroxidáza má molekulovou hmotnost přibližně 44173,9 Da, je to glykoprotein a má čtyři lysinové aminokyselinové zbytky, které se připojují k molekule, která má být označena.

Produkt aktivity křenové peroxidázy je barevná nebo luminiscenční sloučenina vhodná pro detekci a kvantifikaci. HRP se často používá jako součást konjugátů pro detekci určitých molekul. Například v případě Western blottingu se používají HRP konjugáty s protilátkami proti cílovým proteinům nebo molekulám; v tomto případě má protilátka specificitu pro daný cíl a HRP tvoří detekovatelný signál. [2] . Křenová peroxidáza se také používá v technikách, jako je ELISA a pro imunohistochemickou analýzu.

Křenová peroxidáza je ideálním enzymem pro mnoho aplikací, protože je relativně malá, relativně stabilní a levnější než alternativy, jako je alkalická fosfatáza . HRP má větší počet otáček za jednotku času a proto zajišťuje vyvinutí dostatečně silného signálu v relativně krátkém časovém úseku.

Aplikace

V posledních letech se technika značení neuronů křenovou peroxidázou stala jedním z hlavních výzkumných nástrojů. Během krátké doby křenovou peroxidázu od roku 1870 používá více neurovědců než metodu Golgiho barvení . [3]D. Purves a JW Lichtman, Principy nervového vývoje.

Křenová peroxidáza ve volné formě nebo ve formě konjugátů s jinými molekulami vyžaduje přítomnost substrátu pro zobrazení. HRP oxiduje substrát v přítomnosti peroxidu vodíku a vytváří produkty, které lze detekovat spektrofotometricky . [čtyři]

Komerčně dostupné substráty křenové peroxidázy 3,3',5,5'- tetramethylbenzidin ( TMB ) a 3,3'- diaminobenzidin ( DAB ) poskytují při oxidaci barevné produkty, zatímco chemiluminiscenční látky SuperSignal a ECL jsou zdrojem detekovatelného světla při oxidaci .  

Vylepšení chemiluminiscence (ECL)

Křenová peroxidáza katalyzuje oxidaci luminolu na 3 - aminoftalát prostřednictvím řady meziproduktů . Tato reakce je doprovázena nízkou intenzitou záře o vlnové délce 428 nm. V přítomnosti určitých látek je možné dosáhnout až tisícinásobného zvýšení luminiscence. Fenomén zesílení luminiscence se nazývá zesílená chemiluminiscence ( ECL ) .  Nejúčinnějšími zesilovači jsou deriváty fenolu, jako je p-jodfenol. ECL umožňuje detekci asi 0,5 pikogramu nukleové kyseliny na Southern blotu .

Poznámky

1. ↑ PDB 1w4w ; Carlsson GH, Nicholls P., Svistunenko D., Berglund GI, Hajdu J. Komplexy křenové peroxidázy s formiátem, acetátem a oxidem uhelnatým  //  Biochemistry : journal. - 2005. - Leden ( roč. 44 , č. 2 ). - str. 635-642 . - doi : 10.1021/bi0483211 . — PMID 15641789 .
2. ↑ Chau YP, Lu KS Zkoumání bariérových vlastností krevních ganglií u potkaních sympatických ganglií pomocí lanthanového iontu a křenové peroxidázy jako indikátorů   // ACTA ANATOMICA (BASEL): časopis . - 1995. - Sv. 153 , č.p. 2 . - S. 135-144 . — PMID 8560966 .
3. ↑ V posledních letech se hlavním nástrojem stala technika značení neuronů enzymem křenovou peroxidázou. Ve své krátké historii tuto metodu pravděpodobně použilo více neurobiologů , než jich použilo Golgiho skvrnu od jejího objevu v roce 1870.
   Citováno v "Cell Marking with Horseradish Peroxidase" Archivováno 24. dubna 2005 ve Wayback Machine upraveno podle D. Purvese a JW Lichtmana , Principy nervového vývoje. Sinauer Associates, Inc., Sunderland, 1985.
4. ↑ NCVeitch. Křenová peroxidáza: moderní pohled na klasický  enzym //  Fytochemie : deník. - 2004. - Sv. 65 , č. 3 . - str. 249-259 . - doi : 10.1016/j.phytochem.2003.10.022 .

Externí odkazy

• MeSH Křen+peroxidáza