Fluorescenční anizotropie

Fluorescenční anizotropie ( polarizace fluorescence )  je fyzikální jev spočívající v různé intenzitě světla emitovaného fluoroforem podél různých polarizačních os . Průkopníky výzkumu v této oblasti vědy byli Alexander Yablonsky , Gregorio Weber [1] a Andreas Albrecht [2] . Metody založené na analýze fluorescenční polarizace jsou široce používány při screeningu sloučenin s nízkou molekulovou hmotnostíinteragujících s proteiny a při studiu struktury proteinů.

Princip metody

Fenomén fluorescence je založen na přechodu molekuly do excitovaného stavu po absorpci fotonu . Po krátké prodlevě (charakteristická doba fluorescence τ ) se molekula vrátí zpět do základního stavu , odevzdá část energie ve formě tepla a vyzáří další foton. Během těchto dějů dochází k redistribuci elektronů molekuly. V tomto ohledu je excitace fotonem možná pouze při určité orientaci vektoru světelného elektrického pole vzhledem k molekule a emitovaný foton je vůči molekule určitým způsobem polarizován.

Pokud je skupina fluoroforů osvětlena polarizovaným světlem, molekuly, které jsou orientovány v určitém rozsahu úhlů vzhledem k rovině polarizace, přejdou do excitovaného stavu. Pokud jsou nehybné, vyzařované světlo bude také polarizováno pod určitým úhlem. Tato vnitřní anizotropie ( r 0 ) se obvykle měří začleněním fluoroforů do zmrazeného vícesytného alkoholu .

Stupeň polarizace emitovaného světla lze snížit, pokud se fluorofory mohou volně otáčet. Míra poklesu korelace mezi polarizací absorbovaného a emitovaného světla závisí na poměru charakteristické doby změny prostorové orientace fluoroforu ϕ a charakteristické doby fluorescence τ . Důvodem změny orientace fluoroforu může být buď rotace celé molekuly, nebo rotace pouze jejího fragmentu obsahujícího fluorofor. Míra anizotropie souvisí s rychlostí rotace následujícím vztahem:

,

kde r  je pozorovaná anizotropie, r0 je vnitřní  anizotropie molekuly, τ  je charakteristická doba fluorescence a ϕ  je charakteristická doba rotace.

Taková úvaha je použitelná pouze tehdy, když jsou fluorofory dostatečně daleko od sebe. Pokud jsou poblíž, mohou si vyměňovat energii díky Försterově rezonanci ( angl.  FRET ), což vede ke snížení pozorované anizotropie nebo k silnějšímu poklesu korelace. Tato implementace FRET je označována jako emFRET (energetická migrace FRET).

Aplikace

Fluorescenční anizotropii lze použít ke stanovení vazebných konstant nebo ke studiu kinetiky reakcí doprovázených změnami doby rotace molekul. Například, pokud je fluorofor připojen k malé molekule, jeho rychlost rotace se může výrazně snížit, když se naváže na protein. Pokud je fluorofor připojen k větší molekule, rozdíl v polarizaci mezi volným a vázaným stavem bude menší (včetně původně nízké rychlosti rotace velké molekuly), což povede ke snížení přesnosti měření. Stupeň vazby je určen změnou anizotropie mezi volným, částečně vázaným a plně vázaným (v nadbytku bílkovin) stavem titrací .

Pokud je fluorofor připojen k velké molekule, jako je protein nebo RNA , jeho změna v pohyblivosti během skládání může být použita ke studiu dynamiky skládání.

V mikroskopii lze jev fluorescenční polarizace použít ke studiu místní viskozity cytosolu nebo membrán , ke stanovení místní mikrostruktury membrán nebo složení lipidů . To využívá polarizátory umístěné za světelným zdrojem a před kamerou. Tuto techniku ​​lze také použít ke studiu interakce molekul v signálních kaskádách v reakci na různé vlivy.

Fenomén emFRET as ním spojený pokles anizotropie lze využít při studiu agregace proteinů

Poznámky

  1. ↑ Weber, G., 1953. Rotační Brownův pohyb a polarizace fluorescence roztoků. Adv. protein chem. 8:415-459
  2. ↑ Albrecht, A., 1961. Polarizace a přiřazení přechodů: metoda fotoselekce. J. Mol. Spectrosc. 6:84-108.

Literatura