DNA marker

DNA markery (DNA markery), neboli molekulárně genetické markery, jsou polymorfní znak detekovaný metodami molekulární biologie na úrovni nukleotidové sekvence DNA pro konkrétní gen nebo pro jakoukoli jinou část chromozomu při porovnávání genotypů různých jedinců, plemen , odrůdy, linie.

V posledních letech se nashromáždilo mnoho údajů o efektivitě využití molekulárně genetických markerů na úrovni proteinů i DNA , RNA , pro řešení mnoha problémů genetiky, šlechtění, zachování biodiverzity, studia mechanismů evoluce, mapování chromozomů, jakož i pro produkci semen a šlechtění.

Nejpoužívanější molekulárně genetické markery lze podmíněně rozdělit na následující typy - markery úseků strukturních genů kódujících aminokyselinové sekvence proteinů ( elektroforetické varianty proteinů ), markery nekódujících úseků strukturních genů a markery různých DNA sekvence, jejichž vztah ke strukturním genům je obvykle neznámý - distribuce krátkých repetic v celém genomu ( RAPD  - náhodně amplifikovaná polymorfní DNA; ISSR  - invertované repetice; AFLP  - polymorfismus restrikčních míst ) a mikrosatelitních lokusů ( tandemové repetice s elementární jednotkou délka 2-6 nukleotidů).

Pro detekci polymorfismu na úrovni DNA existuje celá řada moderních technologií, mezi kterými lze rozlišit:

• analýza polymorfismu délky restrikčních fragmentů DNA (RFLP);
• analýza polymorfismu pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a dalších metod založených na amplifikaci DNA mezi opakujícími se sekvencemi v genomové DNA.

Markery založené na DNA sondách

• RFLP (RFLP markery, z " polymorfismu délky restrikčních fragmentů "). Hodnocení polymorfismu v délkách restriktivních fragmentů DNA lze provádět různými způsoby, ale nejtradičnější metodou je použití hybridizace blot) [1] . Tato metoda zahrnuje izolaci DNA, získání restrikčních fragmentů, jejich elektroforetickou separaci, přenos na filtry a následnou hybridizaci specifických DNA sond se získanými fragmenty DNA. DNA sonda je relativně krátká sekvence klonované DNA s určitou úrovní homologie a schopností hybridizovat s odpovídající oblastí genomové DNA. Kombinace restrikčních enzymů a sond poskytují vysoce reprodukovatelná polymorfní spektra DNA fragmentů specifických pro každého jedince. Rozdíly mezi posledně jmenovanými mohou být způsobeny například mutacemi, které mění restrikční místo. RFLP má řadu důležitých výhod, včetně vysoké reprodukovatelnosti spekter v různých laboratořích, spoludominantního "chování" markeru. RFLP je účinný při mapování genomu, označuje geny pro mnoho biologických a ekonomicky důležitých vlastností.
• VNTR ( anglicky  Variable Number Tandem Repeat ) je metoda zvaná DNA fingerprinting (“fingerprints”) [2] . Tandemové repetice jsou široce distribuovány v různých genomech a jsou vysoce polymorfní. V důsledku vysoké variability těchto oblastí DNA umožňuje RFLP analýza se sondami pro mikro- a minisatelitní sekvence získat multilokusová spektra s vysokým rozlišením na úrovni populace. Vzhledem k velmi vysoké úrovni polymorfismu je tento přístup v současnosti dobrým nástrojem pro analýzu intra- a interpopulační variability a stanovení genetických vzdáleností mezi skupinami organismů. Alelické varianty VNTR se kodominantně dědí.

PCR markery

Metoda polymerázové řetězové reakce (PCR) zahrnuje použití specifických primerů a produkci diskrétních produktů amplifikace DNA jednotlivých úseků genomové DNA. Na tomto principu je postaveno velké množství souvisejících technologií. Nejpoužívanější technologie RAPD je založena na analýze amplifikovaných polymorfních fragmentů DNA pomocí jednoduchých primerů s libovolnou nukleotidovou sekvencí [3] , [4] , [5] .

• SSR ( anglicky  Simple Sequence Repeats ) - PCR s přilehlými primery ke krátké mini- nebo mikrosatelitní repetici umožňuje identifikovat markery s kodominantní dědičností, a proto je vhodná pro identifikaci heterozygotů pro daný lokus. Avšak jeden pár PCR flank primerů umožňuje uvažovat pouze jeden lokusový polymorfismus. U mnoha mikrosatelitních lokusů není možné detekovat polymorfismus. Ohraničující sekvence pro daný mikrosatelitní lokus jsou zpravidla druhově specifické.
• RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) je  polymerázová řetězová reakce využívající jeden krátký (obvykle 10-merní) primer s libovolnou nukleotidovou sekvencí [6] , [7] . Sekvence primeru není absolutně libovolná, ale je omezena hodnotami složení GC 40-70 % a lingvistickou složitostí nukleotidové sekvence 50-100 %. V RAPD lze použít jeden primer nebo více primerů RAPD. Produkt RAPD je generován amplifikací fragmentu genomové DNA ohraničeného invertovanou sekvencí použitého primeru. Metoda je univerzální pro studie různých druhů za použití stejných primerů. Obecně platí, že primer, který vykazuje vysoký polymorfismus u jednoho druhu, bude účinný i u jiných druhů.
• ISSR ( Inter Simple Sequence Repeats ) [8] [9] je   specializovaná verze metody RAPD, ve které je primer tvořen mikrosatelitní sekvencí. Tato metoda, stejně jako RAPD, používá jeden nebo více primerů dlouhých 15-24 nukleotidů. Ale v tomto případě primery sestávají z tandemových krátkých 2-4 nukleotidových repetic , například 5'- CACACACACACACACACACACACACACAG , a jednoho nebo dvou selektivních nukleotidů na 3' konci primeru. Produkty amplifikace ISSR obsahují na bocích invertovanou mikrosatelitní sekvenci primerů. Protože v této metodě je sekvence primerů specifická a přísněji vybraná než u RAPD, může být nasedání PCR provedeno při vyšší teplotě (55-60 °C) než u metody RAPD, a proto je otisk obvykle lépe reprodukovatelný.
• AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism ) [10]  je technologie, která je kombinací metod RFLP a PCR .  AFLP je komplexní metoda sestávající z několika kroků: genomová DNA je současně restrikována dvěma restrikčními endonukleázami ( EcoRI a Msel ), které rozpoznávají 4 a 6 bází, což vede k fragmentům s přesahujícími 3' konci. Omezená genomová DNA je poté ligována k adaptéru obsahujícímu "lepivé" konce pro restrikční místa ( EcoRI a Msel ). Poté se provedou dvě po sobě jdoucí PCR. První PCR (preamplifikace) používá primery, které jsou plně komplementární k adaptérům EcoRI a Msel . Po první PCR se mezi adaptéry EcoRI a Msel vytvoří velké množství amplifikačních produktů , které je obtížné odlišit pomocí elektroforézy. Proto ve druhé PCR primery s adaptéry EcoRI a Msel obsahují na 3'-konci další a nekomplementární adaptéry od 1 do 3 bází pro selektivní amplifikaci. Separace fragmentů DNA se provádí v polyakrylamidovém gelu s radioaktivním nebo fluorescenčním značením.
• SSAP ( Sequence Specific Amplification Polymorphism ) [11] byla  modifikace metody AFLP k detekci polymorfismu jak v restrikčním místě, tak v místě inzerce.[ jasné ] do genomové DNA transpozonu nebo retrotranspozonu . Genomová DNA studovaných vzorků je štěpena restrikčními enzymy PstI a Msel a jsou získány fragmenty s vyčnívajícími 3'-koncemi. Restrikovaná DNA je poté ligována k adaptérům PstI a Msel . První polymerázová řetězová reakce (preamplifikace) se provádí s primery z adaptérů PstI a Msel , to znamená, že jsou amplifikovány všechny možné kombinace těchto adaptérů v omezené genomové DNA. Po první PCR se vytvoří velké množství amplifikačních produktů fragmentů DNA lokalizovaných mezi primery a adaptéry. Produkty PCR se zředí a použijí pro druhou, selektivní PCR. Druhá PCR se provádí se značeným LTR primerem a jakýmkoli adaptorovým primerem, buď s Pstl nebo Msel . Druhá PCR může použít primery k adaptéru s dalšími nukleotidy na 3' konci, například jedním, dvěma nebo třemi nukleotidy, které nejsou komplementární k adaptéru. Elektroforéza po druhé PCR se provádí v polyakrylamidovém gelu nebo v sekvenátoru, pokud byla použita fluorescenční značka. Produkty amplifikace po druhé PCR se tvoří jako výsledek amplifikace fragmentu DNA mezi sekvencí LTR retrotranspozonu a adaptérem. Získání amplifikačních produktů pouze mezi sekvencemi LTR je v zásadě možné, ale vzdálenost mezi dvěma retrotransposony je zpravidla delší než velikosti obvykle získaných produktů PCR (2500–3000 párů bází). A amplifikační produkty mezi adaptéry nebudou detekovány, protože se používá pouze označení pro LTR primer.
• Archivní kopie IRAP ze dne 30. října  2016 na Wayback Machine  ( Inter Retrotransposone Amplified Polymorphism ) [12] [13]  je polymerázová řetězová reakce mezi primery komplementárními k sekvencím dvou sousedních retrotransposonových LTR . Metoda má několik možností. První verze IRAP používá jeden primer z LTR. Produkty amplifikace se tvoří mezi dvěma invertovanými LTR se stejnou sekvencí, to znamená, že v jednom řetězci je 5' konec jednoho LTR orientován směrem k 3' konci druhého LTR. Pokud je centrální část retrotranspozonu delší než obvyklá velikost PCR produktů (asi 3000 párů bází), pak bude PCR probíhat pouze mezi dvěma LTR z různých retrotranspozic. V tomto případě musí být sousední LTR převráceny. Jiná verze IRAP používá dva různé primery k převráceným LTR: jeden primer na 5' konci a druhý na 3' konci LTR, orientovaný pryč od retrotranspozonu. V tomto případě jsou sousední LTR uspořádány jako přímé dlouhé repetice. A konečně, ve třetí verzi IRAP jsou použity LTR primery z různých retrotrapozonů v různých orientacích. Primery z LTR můžete kombinovat s jinými primery z repetitivní DNA.
• REMAP ( Retrotransposone Microsatellite  Amplified Polymorphism ) [12] [13]  je polymerázová řetězová reakce mezi primerem pro LTR fragment retrotranspozonu a primerem z blízké jednoduché mikrosatelitní repetice (ISSR primer). V tomto případě je poloha amplifikovaného retrotransposonového fragmentu "ukotvena" použitím primeru k mikrosatelitnímu lokusu. Například u rostlin je vhodné použít LTR primer a mikrosatelitní primer (5'-CACACACACACACACACACACACACACAG ) s jedním selektivním nukleotidem na 3' konci primeru. REMAP používá varianty primeru LTR pro 5' konec i 3' konec LTR, jako v IRAP.
• RBIP ( Retrotransposon  -Based Insertion Polymorphisms ) [14]  je metoda založená na použití primerů pro retrotransposonové sekvence a odhalení kodominantních alelických variant. Její princip je založen na multilokusové PCR, která využívá pár primerů lemujících oblast DNA před retrotranspozicí a primer k LTR retrotranspozonu, který je vložen do této oblasti mezi první dva primery. V důsledku PCR bude amplifikována jedna z variant fragmentů ohraničených párem primerů, protože sekvence mezi LTR je příliš dlouhá pro PCR mezi místy genomové DNA s retrotransposonem uvnitř. Tato metoda detekuje polymorfismus pouze pro daný polymorfní lokus. Mezi jeho přednosti patří kodominance polymorfních variant, možnost využití velkého množství odrůd pro dot-blot analýzu.
• iPBS ( inter PBS amplification ) [15]  je metoda založená na použití primerů pro PBS (primer binding site ) retrotransposonové sekvence .  Metoda je účinná pro detekci polymorfismu mezi vzorky, stejně jako pro klonování nových retrotranspozonů v eukaryotech . 
• Jednonukleotidový polymorfismus (SNP).

Poznámky

1. ↑ Southern EM Detekce specifických sekvencí mezi fragmenty DNA oddělenými gelovou elektroforézou  // J  Mol Biol : deník. - 1974. - Sv. 98 , č. 3 . - str. 503-517 . - doi : 10.1016/S0022-2836(75)80083-0 .
2. ↑ Jeffreys AJ, Wilson V., Thein SW Hypervariabilní 'minisatelitní' oblasti v lidské DNA   // Nature . - 1984. - Sv. 314 . - str. 67-73 . - doi : 10.1038/314067a0 .
3. ↑ Kalendar R. Použití molekulárních markerů založených na retrotransposonech k analýze genetické diverzity  //  Field and Vegetable Crops Research: journal. - 2011. - Sv. 48 , č. 2 . - str. 261-274 . - doi : 10.5937/ratpov1102261K .
4. ↑ Kalendar R., Flavell A., Ellis THN, Sjakste T., Moisy C., Schulman AH Analýza rostlinné diverzity pomocí molekulárních markerů na bázi retrotranspozonu  //  Dědičnost : časopis. - 2011. - Sv. 106 . - S. 520-530 . - doi : 10.1038/hdy.2010.93 .
5. ↑ Kalendář R.N., Glazko V.I. Typy molekulárně genetických markerů a jejich aplikace  // Fyziologie a biochemie kulturních rostlin: časopis. - 2002. - T. 34 , č. 4 . - S. 141-156 .  (Ruština) (nedostupný odkaz)
6. ↑ Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV Polymorfismy DNA amplifikované libovolnými primery jsou užitečné jako genetické markery  //  Nucleic Acids Research : deník. - 1990. - Sv. 18 , č. 22 . - S. 6531-6535 . doi : 10.1093 / nar/18.22.6531 .
7. ↑ Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomů pomocí PCR s libovolnými primery  //  Nucleic Acids Research : deník. - 1990. - Sv. 18 . - str. 7213-7218 . doi : 10.1093 / nar/18.24.7213 .
8. ↑ Sivolap Yu.M., Kalendář R.N., Chebotar S.V. Genetický polymorfismus obilných rostlin pomocí PCR s libovolnými primery  // Tsitol Genet. : journal. - 1994. - T. 28 . - S. 54-61 . (Ruština)
9. ↑ Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR ) - amplification polymerase chain reaction   // Genomics  : journal. - Academic Press , 1994. - Sv. 20 , č. 2 . - S. 176-183 . doi : 10.1006 / geno.1994.1151 .
10. ↑ Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., et al. AFLP: nová technika pro DNA fingerprinting  //  Nucleic Acids Research : deník. - 1995. - Sv. 23 . - S. 4407-4414 . doi : 10.1093 / nar/23.21.4407 .
11. ↑ Waugh R., McLean K., Flavell AJ, Pearce SR, Kumar A., ​​​​Thomas BB, Powell W. Genetická distribuce retrotransponovatelných prvků podobných Bare-1 v genomu ječmene odhalená sekvenčně specifickými amplifikačními polymorfismy (S -SAP )  (anglicky)  // Molecular General Genetics: journal. - 1997. - Sv. 253 , č.p. 6 . - str. 687-694 . - doi : 10.1007/s004380050372 .
12. ↑ 1 2 Kalendar R., Grob T., Regina M., Suoniemi A., Schulman AH IRAP a REMAP: Dvě nové techniky snímání DNA založené na retrotransposonech   // Teoretická a aplikovaná genetika : deník. - 1999. - Sv. 98 . - str. 704-711 . - doi : 10.1007/s001220051124 .
13. ↑ 1 2 Kalendar R., Schulman AH IRAP a REMAP pro genotypizaci na základě retrotranspozonu a otisky prstů   // Nature Protocols : deník. - 2006. - Sv. 1 , ne. 5 . - str. 2478-2484 . - doi : 10.1038/nprot.2006.377 .
14. ↑ Flavell AJ, Knox MR, Pearce SR, Ellis THN. Polymorfismy inzerce založené na retrotranspozonu (RBIP) pro vysoce výkonnou analýzu markerů  //  The Plant Journal : deník. - 1998. - Sv. 16 , č. 5 . - S. 643-650 . - doi : 10.1046/j.1365-313x.1998.00334.x .
15. ↑ Kalendar R., Antonius K., Smykal P., Schulman AH  iPBS : Univerzální metoda pro DNA fingerprinting a izolaci retrotranspozonu  // Teoretická a aplikovaná genetika : deník. - 2010. - Sv. 121 , č.p. 8 . - S. 1419-1430 . - doi : 10.1007/s00122-010-1398-2 .