Kolonie tvořící jednotka (zkr. CFU ) je jednotka, která vyhodnocuje počet mikrobiálních buněk ( bakterií , hub , virů atd.) ve vzorku, které jsou životaschopné a schopné se množit dělením za kontrolovaných podmínek. Počítání jednotek tvořících kolonie vyžaduje kultivaci mikroorganismů a počítání pouze životaschopných buněk, na rozdíl od mikroskopického vyšetření, které počítá všechny buňky, živé i mrtvé. Vizuální počítání kolonií v buněčné kultuře po naočkování je možné až po vytvoření velkých kolonií a při jejich počítání nemusí být jasné, zda pochází z jedné buňky nebo skupiny buněk. Vyjádření výsledků jako jednotky tvořící kolonie může tuto nejistotu odstranit.
Účelem počítání na plotnách je odhadnout počet přítomných buněk na základě jejich schopnosti tvořit kolonie za určitých podmínek média, teploty a času. Teoreticky jedna životaschopná buňka může dát vznik kolonii replikací. Jednotlivé buňky jsou však výjimkou a progenitorem kolonie je nejčastěji skupina buněk, které existují společně. Navíc mnoho bakterií roste v řetězcích (např . Streptococcus ) nebo shlucích (např . Staphylococcus ). Z těchto důvodů je odhad počtu mikrobů využívajících CFU ve většině případů menší než skutečný počet jednotlivých živých buněk přítomných ve vzorku. Počet CFU předpokládá, že každá kolonie je samostatná a je založena na jediné životaschopné mikrobiální buňce [1] .
Například počet CFU pro E. coli metodou plotny je lineární v rozsahu 30 až 300 jednotek na Petriho misce standardní velikosti [2] . Aby se tedy zajistilo, že vzorek bude produkovat CFU v tomto rozsahu, je zapotřebí sériová ředění několika kultur. Zpravidla se používají desetinásobná ředění a série ředění se vysévají ve dvou nebo třech opakováních ve zvoleném rozsahu ředění. Často se naočkuje 100 µl směsi, ale používají se i větší množství (až 1 ml ) . Větší objemy povlaku prodlužují dobu schnutí, ale často nevedou k vyšší přesnosti, protože mohou být vyžadovány další kroky ředění [3] . Dále se spočítají kolonie v lineárním rozsahu a poté se matematicky odvodí poměry CFU/ g (nebo CFU/ml) v počáteční směsi, přičemž se vezme v úvahu aplikované množství a jeho faktor ředění.
Směs se známou neznámou koncentrací mikroorganismů se často sériově ředí, aby se získala alespoň jedna miska s počitatelným počtem kolonií. Výhodou této metody je, že různé typy mikroorganismů mohou produkovat kolonie, které se od sebe jasně liší jak mikroskopicky, tak makroskopicky. Morfologie kolonií může být velmi nápomocná při identifikaci přítomných mikroorganismů.
Předběžné zkoumání morfologie kolonií mikroorganismu může poskytnout lepší pochopení toho, jak pozorované CFU/ml souvisí s počtem životaschopných buněk na mililitr. Alternativně lze v některých případech průměrný počet buněk na CFU snížit protřepáním vzorku před zředěním. Mnoho mikroorganismů je však příliš citlivých na třepání a po umístění do Petriho misky se může snížit podíl životaschopných buněk.
Koncentrace jednotek tvořících kolonie mohou být vyjádřeny jak v absolutních hodnotách, tak v logaritmických hodnotách, kde hodnota je základní 10 logaritmus koncentrace .
Počítání kolonií se tradičně provádí ručně pomocí pera a počítadla kliknutí. To je obvykle jednoduchý úkol, ale může být velmi pracný a časově náročný, pokud existuje mnoho vzorků k výpočtu. Alternativně lze použít poloautomatická (softwarová) a automatická (hardwarová a softwarová) řešení.
Kolonie lze očíslovat z fotografií destiček se vzorky pomocí softwarových nástrojů. Za tímto účelem je každá Petriho miska obvykle vyfotografována a poté jsou všechny snímky analyzovány. To lze provést pomocí jednoduchého digitálního fotoaparátu nebo dokonce webové kamery. Protože získání jednoho snímku obvykle trvá méně než 10 sekund, na rozdíl od několika minut pro ruční počítání CFU, tento přístup obvykle ušetří spoustu času. Je také objektivnější a umožňuje extrahovat další proměnné, jako je velikost kolonie a barva.
Kromě PC softwaru jsou pro zařízení Android a iOS k dispozici aplikace pro poloautomatické a automatické počítání kolonií. K fotografování agarové plotny se používá vestavěná kamera a interní nebo externí algoritmus zpracovává obrazová data a odhaduje počet kolonií [9] [10] [11] .
Automatizované systémy se používají k potlačení lidských chyb, protože mnoho metod počítání lidských buněk má vysokou pravděpodobnost chyby. Protože výzkumníci rutinně ručně počítají buňky pomocí procházejícího světla, tato metoda náchylná k chybám může mít významný dopad na vypočítanou koncentraci v počátečním kapalném médiu, zvláště když jsou buňky zpočátku ve směsi v nízké koncentraci.
Plně automatizované systémy jsou také dostupné od některých výrobců biotechnologií [12] . Obvykle jsou drahé a nejsou tak flexibilní jako samostatný software, protože hardware a software jsou navrženy tak, aby spolupracovaly v konkrétní konfiguraci.
Některé automatizované systémy, jako jsou systémy MATLAB, umožňují počítání buněk bez nutnosti barvení. To umožňuje kolonie znovu použít pro další experimenty bez rizika zničení kolonií mikroorganismů. Nevýhodou těchto automatizovaných systémů však je, že je extrémně obtížné odlišit kolonie od nahromadění prachu nebo škrábanců na krevních agarových miskách, protože jak prach, tak škrábance mohou vytvářet širokou škálu kombinací tvarů a vzhledů [13] .
Místo jednotek tvořících kolonie můžete použít parametry "Nejpravděpodobnější číslo" (angl. Most probable number, MPN), stejně jako Modified Fishman Units (MFU). Nejpravděpodobnější metoda počtu počítá životaschopné buňky, což je užitečné při počítání nízkých koncentrací buněk nebo počítání mikroorganismů obsažených v produktech, ve kterých cizí částice znemožňují počítání na Petriho miskách. Modifikované jednotky Fishman také berou v úvahu mikroorganismy, které jsou životaschopné, ale nejsou z jakéhokoli důvodu kultivovány.