Metoda lokální fixace potenciálu , patch-clamp ( angl. patch - fragment, svorka zde - fixace) je elektrofyziologická technika pro studium vlastností iontových kanálů , spočívající v tom, že se fragment buněčné membrány izoluje pomocí speciálního mikropipeta. Tato technika umožňuje experimentátorovi kontrolovat potenciální rozdíl mezi stranami membrány a také ji umístit do prostředí s určitým chemickým složením. Za těchto dobře kontrolovaných podmínek se měří iontové proudy procházející membránou, což nakonec vede k závěrům o tom, jak iontové kanály reagují na elektrickou a chemickou stimulaci. Metoda je tak citlivá, že umožňuje pozorovat chování a chemické přeměny jednotlivých molekul interagujících s membránou. [1] Experimentální protokoly byly vyvinuty pro měření charakteristik iontových kanálů optimálním způsobem. Němečtí výzkumníci Erwin Neher a Bert Sakmann , kteří tuto techniku vyvinuli, obdrželi v roce 1991 Nobelovu cenu .
Živé buňky jsou pokryty membránou , jejímž strukturálním základem je dvojitá vrstva lipidů , mírně propustná pro vodu a prakticky nepropustná pro ionty. Každá buňka si musí s vnějším prostředím vyměňovat různé látky a zejména ionty. Transport iontů přes membránu hraje důležitou roli v procesech buněčné excitace a přenosu signálu. Ionty vstupují do buňky a opouštějí ji proteinovými strukturami zabudovanými do membrány – kanály a transportéry [2]
Transportéry jsou membránové proteiny , které se vážou na transportovanou látku na jedné straně membrány, přenášejí tuto látku přes membránu a poté ji uvolňují. Takový přenos je možný, protože v důsledku spojení s látkou přenašeč změní konformaci (tj. tvar, orientaci). Nejdůležitějším transportérem v eukaryotických buňkách je sodíkovo-draslíková pumpa . Aby tato pumpa fungovala, je zapotřebí energie, kterou čerpá z ATP uloženého v buňce . Během jednoho cyklu své činnosti pumpa odebere z buňky 3 ionty Na + a zavede do ní 2 ionty K + . Jedna molekula tohoto transportéru udělá asi 10³ cyklů za sekundu. Podobná frekvence cyklů je typická i pro ostatní typy dopravníků [3] .
Kanály jsou proteiny , které fungují jako membránové póry, protože tvoří otvory, kterými mohou procházet ionty. Membránové kanály jsou selektivní – propustné pouze pro určité látky. Selektivita je způsobena poloměrem pórů a distribucí nabitých funkčních skupin v nich. Existují kanály, které selektivně propouštějí sodíkové ionty (sodíkové kanály), stejně jako draslíkové, vápenaté a chloridové kanály. Pro každý typ iontu není jeden, ale několik typů kanálů [4] . 10 6 - 10 7 iontů projde jedním kanálem za sekundu [3] .
Přes zásadní rozdíly v mechanismu transportu přes kanály a transportéry je mohou tvořit vysoce homologní proteiny. Takže nedávno obdržená data , že mutace jedné aminokyseliny v proteinu transportéru dvojmocného kovu DMT1 vede k jeho transformaci na vápníkový kanál . Kromě toho existuje alespoň jeden transportér (erytrocytový chlorid-hydrogenuhličitanový výměník), který provádí 10 5 přenosů za sekundu [3] , což je velmi blízké rychlostem charakteristickým pro kanály a naznačuje existenci nějakého „mezilehlého“ mezi kanály a mechanismy dopravníků.
Protože ionty jsou elektricky nabité molekuly, při průchodu membránovými kanály se také přenese náboj, což znamená, že membránou protéká elektrický proud. Tento proud lze měřit. Čím větší je rozdíl potenciálů mezi stranami membrány, tím větší je proud. Vodivost (poměr rozdílu proudu k potenciálu) jednoho kanálu v otevřeném stavu se liší v závislosti na typu kanálu, od 4–5 (v CFTR [5] a ENaC [6] ) do 30–50 (např. cholinergní receptor citlivý na nikotin [7•] ) pikosiemens . To znamená, že při rozdílu potenciálů 100 mV bude kanálem protékat proud několika pikoampérů.
Elektrické jevy na buněčných membránách lze měřit pomocí ostrých skleněných mikroelektrod , které jsou vloženy do článku. Technika s jednou intracelulární elektrodou umožňuje měřit rozdíl potenciálů při fixním proudu. Méně často může tato technika měřit proud při pevném potenciálu pomocí techniky spínacích kleští. Všechna měření probíhají výhradně na celé buňce, čímž se studují elektrické vlastnosti celé buněčné membrány.
Skutečnost, že fixace transmembránového potenciálu umožní měřit vodivost membrány ze změn proudu při konstantním napětí, byla poprvé rozpoznána ve 40. letech 20. století. XX století a brzy angličtí výzkumníci Alan Hodgkin a Andrew Huxley ( Alan Hodgkin a Andrew Huxley ) zahájili experimenty s dvouelektrodovou potenciální svorkou (2-elektrodovou napěťovou svorkou). [8] Podstata metody je následující. Do článku jsou vloženy dvě elektrody, jedna další - referenční elektroda - zůstává mimo článek. První intracelulární elektroda slouží k měření transmembránového potenciálového rozdílu (tedy potenciálového rozdílu mezi ní a referenční elektrodou), druhá může dodávat proud. Pro napájení proudu a měření rozdílu potenciálu není možné použít stejnou ostrou elektrodu. Faktem je, že taková elektroda má vstupní elektrický odpor řádově 100-200 MΩ, což je srovnatelné s odporem buněčné membrány, takže pokud proud protéká systémem "elektroda-článek", pak pokles napětí na elektrodě bude úměrná poklesu napětí na samotné membráně a neexistuje způsob, jak tyto dvě části oddělit [8] . Dále speciální zařízení - generátor signálu - nastavuje řídicí potenciál , který by se měl rovnat transmembránovému potenciálu. Naměřený transmembránový potenciál je přiveden na vstup porovnávacího zařízení , které odečítá naměřený potenciál od příkazového a podle velikosti rozdílu dodává proud do proudové elektrody tak, aby tento rozdíl kompenzoval. Monitor proudu zase neustále měří množství proudu, který je k tomu zapotřebí. Ve 40. a 50. letech, kdy Hodgkin a Huxley pracovali, neexistovaly žádné mikroelektrody, takže se jako intracelulární elektrody používaly tenké dráty. To určilo výběr objektu — obřího axonu olihně o průměru 1 mm, do kterého byly tyto dráty vloženy. Na tomto objektu pomocí metody dvouelektrodové fixace potenciálu výzkumníci prováděli experimenty, ve kterých byla stanovena iontová povaha akčního potenciálu a poprvé byla postulována existence iontových kanálů (Nobelova cena v roce 1963 , sdílená s J. Ecclesem , který obdržel za výzkum v oblasti synaptického přenosu). Upínání dvouelektrodového potenciálu se používá dodnes, a to pomocí ostrých skleněných mikroelektrod, ale i u nich má tato technika značná omezení: dvě elektrody lze vložit pouze do velmi velké buňky (například do žabího oocytu).
Na konci sedmdesátých let XX století. Erwin Neher (E.Neher) a Bert Sakman (B.Sakmann) zjistili, že skleněné pipety ve tvaru kužele s průměrem špičky 1-2 mikrony mohou vytvářet kontakty s buněčnou membránou (hranice membránového skla) s odporem několika gigaohmů. - jedná se o takzvaný gigaohmový kontakt . Umožňuje izolovat od vnějšího prostředí a od zbytku membrány ten fragment, který je uvnitř pipety. Fragment membrány ohraničený pipetou se nazývá patch - „fragment“, slovo svorka (fixace) v názvu metody lze interpretovat jak jako zachycení a izolaci tohoto fragmentu, tak i jako fixaci transmembránového potenciálu v izolovaný fragment, nebo, jak bude popsáno později, potenciál nebo proud na celé buňce. [9] Stříbro-chlorová elektroda je umístěna v pipetě naplněné roztokem elektrolytu, druhá elektroda je umístěna extracelulárně, v promývací kapalině. Elektrický obvod se liší od dříve popsaného pro dvouelektrodovou fixaci v tom, že stejná elektroda se používá jak pro měření rozdílu potenciálů, tak pro aplikaci proudu, což je možné díky relativně nízkému odporu pipety.
Fotografie 1 ukazuje část takového nastavení.
Obrovská koule, jejíž část je viditelná na monitoru uprostřed fotografie, je buňka (oocyt žáby Xenopus laevis ), která je právě na mikroskopu, je k ní připojena náplastová pipeta, její průměr u nosu je asi 3 mikrony. Po navázání gigaohmového kontaktu izoluje fragment membrány o ploše přibližně 7 μm², lze zaznamenat proud z iontových kanálů v tomto fragmentu.
Právě popsaná konfigurace se nazývá náplastová svorka připojená k buňce (patch-clamp). Je to znázorněno na obrázku 2.
Tato konfigurace má však dvě nevýhody.
Jednak neumožňuje dostatečně spolehlivé měření a následně ani nastavení transmembránového potenciálového rozdílu, protože obě elektrody, jak pipetová, tak externí, jsou na stejné straně membrány. Obecně řečeno, je možné pomocí promývacího roztoku s iontovým složením, které napodobuje složení cytoplazmy , depolarizovat membránu mimo pipetu tak, že rozdíl potenciálů mezi vnější elektrodou a cytoplazmou zmizí, a poté rozdíl potenciálů mezi elektrodami se bude rovnat transmembránovému potenciálu - ale to vše je velmi přibližné, protože přesné složení cytoplazmy nám není známo.
Za druhé, tato konfigurace neumožňuje kontrolovat složení média mimo pipetu – zůstává tam cytoplazma, jejíž složení není zcela určeno.
Do jisté míry je však tato vlastnost konfigurace s připojenými buňkami také výhodou: tato konfigurace umožňuje pracovat v podmínkách, které jsou nejbližší fyziologickým.
Pokud je však pipeta vyjmuta z kyvety rychlým pohybem, pak se „vnitřní“ kus membrány uvolní z kyvety a získá se konfigurace zevnitř ven (vnější strana uvnitř), pojmenovaná proto, že vnitřní strana membrány, obvykle obrácená k cytoplazmě, bude venku - v promývacím roztoku a vnější strana je uvnitř pipety. (Schéma 3.) Alternativní způsob přechodu do konfigurace inside-out je následující: z konfigurace s připojenými buňkami je pipeta vytažena hladce, čímž se na obou stranách vytvoří uzavřená vezikula; poté zvedněte pipetu do vzduchu a spusťte ji do druhé lázně s intracelulárním roztokem. Během přenosu je vnější membrána vezikuly zničena, což má za následek vytvoření konfigurace zevnitř ven.
Nyní se potenciálový rozdíl na membránovém fragmentu přesně rovná potenciálnímu rozdílu mezi elektrodami. Je zřejmé, že při použití této modifikace je pipeta naplněna roztokem, který napodobuje extracelulární prostředí, zatímco promývací roztok je svým složením blízko cytoplazmě . Zároveň je možné změnou složení promývacího roztoku studovat, jak takové změny v cytoplazmě ovlivňují proud kanálů, které nás zajímají - vždyť promývací roztok je v kontaktu s cytoplazmatickou stranou membrány) . Zároveň přesně známe jak složení kapaliny na obou stranách membrány, tak rozdíl potenciálů, což nám umožňuje přesně charakterizovat kanály pomocí biofyzikálních rovnic Nernsta a Goldman-Hodgkin-Katze. Současně, pokud se jeden kanál dostal do izolované části membrány, pak pozorujeme chování jedné molekuly, a pokud se jedná o ligandem regulovaný kanál- receptor , pak její interakci s ostatními jednotlivými molekulami.
Pokud je podle podmínek experimentu nutné změnit složení extracelulárního média , lze použít celou buněčnou konfiguraci . V tomto případě se pipeta nevytahuje z cely, ale působí na ni podtlak, a tím dochází ke zničení izolovaného fragmentu membrány.
Poté je pipeta připojena k intracelulárnímu prostředí; protože buňka je obvykle malá, pak se díky difúzi brzy ukáže , že složení cytoplazmy je shodné se složením roztoku pipety, takže stejně jako v předchozím případě známe jak složení kapalin, tak i potenciální rozdíl. Všimněte si, že pokud v konfiguraci naruby byla elektroda pipety „extracelulární“ a vnitřní elektroda byla „intracelulární“, nyní se jejich role obrátila. Z hlediska studia proudu přes kanály je výhodou této metody, že jsou zde zachovány buněčné struktury a regulační mechanismy. Pravda, nízkomolekulární látky mohou difundovat z cytoplazmy do pipety a naopak, takže nelze dosáhnout úplného zachování regulačních mechanismů v této konfiguraci. Za jistou nevýhodu konfigurace lze považovat to, že se měří celkový proud všech kanálů v článku a ne proudy jednotlivými kanály, to znamená, že rozlišení této metody je nižší než u konfigurací s protrženou membránou.
Pro vyřešení problému se sníženým rozlišením metody umožňuje konfigurace zvenčí-ven (vnější strana venku). Pokud se po přepnutí do režimu celé buňky pipeta pomalu vyjme z buňky, membrána se okamžitě nestrhne, ale začne se natahovat do zkumavky - je to vidět na fotografii 5.
Vezměte prosím na vědomí, že v pipetě jsou dobře viditelné kousky cytoplazmy , které se tam dostaly po destrukci membrány při přechodu do celé buňky.
Další fáze procesu je znázorněna na obrázku 6.
Membránová trubice se stala velmi tenkou a téměř neviditelnou („ výraznost “ na povrchu buňky je malá část cytoplazmy zbývající v membránové trubici). V příštím okamžiku se trubice rozbije a membrána se na pipetě uzavře v „obrácené“ podobě – ocitneme se v konfiguraci „venku“
Takže pipeta a její elektroda, stejně jako konfigurace celé buňky, jsou intracelulární, volně měníme složení extracelulárního roztoku, plocha studované membrány je malá, takže můžeme opět studovat jednotlivé kanály.
Perforovaná záplata je specifická varianta záplatovací svorky v celobuněčném režimu. V tomto případě roztok pipety obsahuje malé množství speciálního antibiotika , například amfotericin-B nebo gramicidin . Antibiotika této třídy tvoří iontové kanály v buněčné membráně v místě připojeném k mikropipetě.
Tento přístup umožňuje vyhnout se nahrazení vnitřního prostředí buňky roztokem z pipety-elektrody, to znamená, že buňka zůstane živá s co nejmenším poškozením. Reakce buňky na podněty se tedy co nejvíce blíží těm přirozeným. Zároveň má tato metoda řadu nevýhod. Za prvé, oproti klasickému celočlánkovému režimu je vstupní elektrický odpor (který se skládá převážně z odporu pipety a odporu v místě přechodu pipety s membránou) výrazně vyšší. To snižuje kvalitu uchycení potenciálu, zvyšuje hladinu šumu během záznamu a zvyšuje hodnoty všech chyb spojených se změnami odporu celého obvodu (od elektrody v externím roztoku k elektrodě v pipetě). Za druhé, trvá poměrně dlouho (až 30 minut) , než antibiotikum zabere, což výrazně zkracuje užitečnou dobu experimentu. A za třetí, antibiotikum také poškozuje membránu v místě spojení se špičkou pipety, což vede k urychlené destrukci gigaohmového kontaktu a navíc snižuje efektivní dobu experimentu. Tuto verzi metody lze tedy úspěšně použít pouze v experimentech, které nevyžadují dlouhou dobu ke studiu zkoumaných jevů.
Zajímavou variantou náplasti je náplast s jádrem. (Upevnění potenciálu buněčným jádrem [11] ).
Metoda je následující. Pipeta je přivedena k cele a poté trhaně prorazí membránu. Poté je špička pipety přivedena k buněčnému jádru, na pipetu je aplikován mírný podtlak. Výsledkem je, že se pipeta přilepí k jádru. Poté se pipeta s jádrem na konci hladce stáhne zpět a vyjme z klece. Pipeta musí být vyjmuta z cely tak, aby část membrány na výstupním bodě „nasadila“ připojené jádro a odlomila se a ovinula se kolem něj. Výsledkem je specifická verze vnější náplasti, ve které je mnohem větší část membrány než v obvyklé verzi metody připevněna ke konci pipety a je obalena kolem buněčného jádra.
Když se studují změny ve vodivosti kanálů stejného typu v reakci na nějaké chemické působení nebo závislost jejich vodivosti na rozdílu potenciálu na membráně, je vhodné stanovit potenciál a měřit kanálový proud, jak jsme popsali. zatím. Tento nejběžnější typ náplasti se nazývá napěťová svorka. Někdy se však výzkumník zajímá o procesy transmembránového transportu iontů spojené se změnou membránového potenciálu – například vedení nervového vzruchu. V takových případech můžete udělat opak: opravit proud na konstantní úrovni a v tomto případě studovat změny potenciálového rozdílu. Tato možnost se nazývá proudová svorka (fixace proudu).
Záznam jednoho kanálu glycinového receptoru . Dobře jsou vidět dva stavy: zavřený (odpovídá nulovému proudu) a otevřený (odpovídá proudu asi 7 pikoampérů). Kanál čas od času spontánně přechází z jednoho stavu do druhého, neexistují žádné přechodné stavy. Záznam umožňuje získat dvě z nejdůležitějších charakteristik kanálu: vodivost (na základě hodnot transmembránového potenciálu a proudu) a pravděpodobnost, že bude v otevřeném stavu (definovaná jako poměr času, kdy kanál je otevřena do doby, kdy je proud zaznamenán). Mimochodem, nejčastěji je aktivita kanálu fyziologicky regulována změnou této pravděpodobnosti.
Vstup v konfiguraci celé buňky. Sběr epiteliálních buněk kanálku. Transmembránový potenciál −60 mV. V intervalech 1 minuta po dobu 30 sekund se do promývacího roztoku vstřikuje amilorid, inhibitor epiteliálního sodíkového kanálu (doba podání je znázorněna tmavými obdélníky). Mimochodem, citlivost na inhibitory je další z nejdůležitějších vlastností kanálu. Zavedení amiloridu pokaždé vede k poklesu proudu na nulu, což znamená, že téměř veškerá vodivost při -60 mV v této buňce je vodivostí epiteliálního sodíkového kanálu . Oproti předchozímu záznamu se současné změny zdají být kontinuální - je to způsobeno tím, že je nahráváno mnoho kanálů současně (asi 2000), respektive existuje přibližně 2000 aktuálních úrovní - od "všechny otevřené" po "vše uzavřeno".
Jedná se o techniku vyvinutou pro zvýšení produktivity v elektrofyziologii, když jsou vyžadována hromadná měření transmembránové vodivosti. Zejména tato metoda nachází uplatnění ve farmakologickém výzkumu. Pokud je u klasického patch-clampu umístěna pipeta na stacionární buňku, pak u rovinné je naopak buněčná suspenze nanesena na mikročip s uspořádanými otvory subcelulárního průměru. Buňka se usadí na otvor, nasaje se k němu pomocí pumpy, v důsledku čehož se vytvoří gigaohmový kontakt. Dále se studie provádí podle stejného principu jako u tradiční náplasti. [12] [13]
Hlavní výhodou planární patch-clamp je, že experiment je mnohem jednodušší, vyžaduje od výzkumníka méně dovednosti a zabere méně času. Poměrně mnoho měření lze provést jedno po druhém automaticky. Podle autorů techniky tato metoda usnadňuje perfuzi intracelulárního obsahu a také přesnější dávkování studovaných či testovaných farmakologických látek. Touto metodou je poměrně snadné pracovat s buňkami, které jsou obvykle v suspenzi - zejména s krvinkami.
Planární metoda patch-clamp má však řadu významných omezení. Hlavní věc je, že studované buňky musí být v suspenzi. V souladu s tím není možné pracovat s tkáňovými fragmenty, je nemožné studovat vzájemné působení buněk. K mobilizaci buněk je nutné použít proteázové enzymy, které mohou modifikovat chování studovaných iontových kanálů.
Vše výše uvedené vede k tomu, že planární náplastová svorka nachází uplatnění především ve farmakologických screeningových studiích, kde jsou vyžadována hromadná měření, ale není tak běžná v oblasti základní vědy.