Skleněná mikroelektroda

Skleněná mikroelektroda  je velmi tenká skleněná pipeta naplněná elektrolytem . Používá se v elektrofyziologii . Rozvoj mikroelektrodových metod umožnil provádět elektrofyziologické studie na úrovni jednotlivých buněk.

Průměr hrotu skleněné mikroelektrody je asi 0,5 µm, někdy méně než 0,1 µm [1] , při pozorování optickým mikroskopem může být k nerozeznání.

Tento přístroj by neměl být zaměňován se štíhlými modely ionometrických skleněných elektrod , zejména s těmi, které se také používají v elektrofyziologii.

Aplikace

Existují tři hlavní způsoby použití mikroelektrod:

Dalším vývojem mikroelektrodové technologie byla metoda lokální fixace potenciálu ( metoda patch clamp ) [2] . Speciální typy mikroelektrod vyvinuté pro tuto metodu se běžně označují jako mikropipety . Citlivost metody umožňuje registrovat aktivitu jednotlivých iontových kanálů buněčné membrány.

Historie

Před vývojem skleněných mikroelektrod ve fyziologii se používaly kovové elektrody např. z elektrochemicky broušeného wolframového drátu [3] . Nízký elektrický odpor kovových elektrod umožnil použít s nimi primitivní záznamová zařízení s nízkým vstupním odporem. V některých oblastech se takové elektrody používají dodnes.

Skleněné mikroelektrody byly poprvé použity v roce 1949 [4] G. Lingem a R. V. Gerardem ve své práci o záznamu membránového potenciálu žabích myocytů .

V. L. Nastuk a A. L. Chodžkin v roce 1950 pomocí [5] mikroelektrodové techniky zaregistrovali akční potenciál svalového vlákna.

Použití skleněných mikroelektrod pro aplikaci látek na buněčnou membránu navrhl VL Nastuk v roce 1953 [6] .

V SSSR zavedl mikroelektrodovou techniku ​​do praxe Platon Grigorjevič Kostyuk [7] . Na Biologické fakultě Moskevské státní univerzity použil G. A. Kurella ve své práci jak mikroelektrodovou techniku, tak miniaturní skleněné ionometrické elektrody pro studium subcelulárních struktur.[ upřesnit ] [8] .

Návrh a výroba

Materiálem pro výrobu mikroelektrod je skleněná kapilára o průměru cca 1 mm. Obvykle používají značku skla " Pyrex ", méně často používají jiné typy skla - hlinitokřemičitanové 38-ЗС a křemenné sklo. Často je kapilára se skleněnými vlákny do ní zatavená jako polotovary - v tomto případě je v budoucnu usnadněno plnění mikroelektrody elektrolytem. Přířezy jsou důkladně vyčištěny.

Příprava mikropipety

Skleněná mikroelektroda se vyrábí natažením a rozbitím zahřáté kapiláry na speciálním zařízení - stahováku (mikrokovárně). Parametry výsledné mikroelektrody závisí na zvoleném typu skla, průměru kapiláry, teplotě ohřevu, okamžiku začátku trhnutí a jeho síle. [1] Nejpokročilejší modely moderních stahováků řízených mikroprocesorem umožňují programovat různé tvary hrotu výsuvné mikropipety [9] , poskytující předem dané vlastnosti a dobrou opakovatelnost.

Válcová část výsledného obrobku se postupně zužuje a mění se v děrovací část. Podlouhlé mikropipety se zkoumají pod mikroskopem, s průměrem piercingové špičky menším než 0,5 μm je nerozeznatelný, ztrácí se v interferenčním proužku. V některých případech je hrot mikroelektrody dodatečně nabroušen nebo speciálním způsobem roztaven.

Mikroelektrody pro náplastové svorky jsou navíc potaženy silikonem pro zajištění vytvoření gigaohmového kontaktu při dotyku buněčné membrány.

Plnění elektrody

Obrobek se plní elektrolytem, ​​nejčastěji 2–3 M roztokem chloridu draselného. Někdy se používají elektrolyty jiného složení nebo se elektroda naplní nízkotavitelným kovem, např. Woodovou slitinou [10] .

Plnění elektrod může být obtížné kvůli velmi malému průměru její pracovní části. Pro jeho usnadnění byla navržena řada technik: naplnění vakua, předplnění alkoholem a následné vytěsnění alkoholu elektrolytem [11] . V současné době je široce využívána metoda navržená Tasakim [12] využívající skleněné vlákno zatavené do mikropipety, přičemž mikroelektroda je naplněna působením kapilárních sil [13] .

Připojení a ovládání

Pro připojení elektrod k měřicímu zařízení se elektrody upevní do kleštinového držáku naplněného elektrolytem nebo se do válcové části plněné elektrody zasune drát z chlorovaného stříbra .

Kvalita naplněné a připojené mikroelektrody se kontroluje měřením jejího odporu, který má řádově jednotky megaohmů. Nižší odpor značí, že hrot mikroelektrody je odlomený, větší nebo chaoticky se měnící odpor značí, že hrot piercingu je zanesený nečistotami.

Hotové mikroelektrody se špatně skladují, proto se většinou zhotovují bezprostředně před začátkem experimentu [14] . Po nějakou dobu, ne více než jeden den, mohou být uloženy v chladničce, ponořené ve sklenici s elektrolytem. Při dlouhodobém skladování ztrácejí elektrody svou využitelnost krystalizací elektrolytu, je možné je přerůst koloniemi mikroorganismů [15] .

Fyzikální a chemické vlastnosti mikroelektrod

Mezi mikroelektrodou a prostředím, do kterého je ponořena (fyziologický roztok, obsah buněk) probíhají různé fyzikálně-chemické procesy.

Elektrické vlastnosti mikroelektrod

Elektrický odpor  je nejdůležitějším parametrem mikroelektrody. Odpor je nutné kontrolovat před začátkem experimentu a v některých případech i během práce. Pro platnou elektrodu je odpor mezi 5 a 20 MΩ. Odpor menší než 1 MΩ je známkou zlomené propichovací části, více než 60 MΩ - hrot elektrody je příliš tenký, nebo zanesený vysráženými krystaly nebo částicemi studovaného předmětu [17] . Náhodně se měnící odpor je také charakteristický pro znečištěnou elektrodu [14] . Elektrody s vysokým odporem mají velký vlastní šum a citlivost na elektromagnetické rušení. Při proudech přesahujících 1 nA se proudově-napěťové charakteristiky mikroelektrod mohou stát nelineárními. Výpočet odporu elektrod je možný, ale je komplikovaný a neposkytuje vysokou přesnost, proto se v praxi odpor elektrody stanovuje experimentálně [18] .

kapacita elektrody . Přítomnost mikroelektrody vlastní kapacity zkresluje tvar zaznamenávaného signálu. Proto jsou snahy o jeho zmenšení a kompenzaci: zvětšit průměr válcové části elektrody, zmenšit její délku, pokusit se použít co nejkratší vodiče pro připojení k zesilovači. Pro kompenzaci kapacity elektrody ve vstupním stupni zesilovače se používá kapacitní záporná zpětná vazba . Kapacitní kompenzace je řízena přivedením obdélníkového signálu na elektrodu  - při správném nastavení nedochází ke zkreslení tvaru její přední strany [19] .

Potenciál posunutí . Vyskytuje se z několika důvodů. Hlavní jsou:

Předpětí elektrody připojené k zesilovači a ponořené do fyziologického roztoku je kompenzováno nastavením zesilovače.

Ke snížení nežádoucího vlastního potenciálu se také používají následující metody [21] :

Typy mikroelektrod

Vícekanálové mikroelektrody

Vícekanálové mikroelektrody se často používají ve studiích využívajících iontoforézu (mikroelektroforézu). Umožňují současnou registraci elektrické aktivity a zavádění účinných látek ze sousedních šachet mikropipet. Obvykle je počet kanálů takto složité elektrody alespoň tři: jeden slouží pro registraci, druhý pro kompenzaci a řízení proudových účinků a třetí pro zavedení testované látky [22] .

Jednotlivé kanály mohou být uspořádány vzájemně paralelně nebo koaxiálně.

Velká parazitní kapacita vícekanálových mikroelektrod je někdy kompenzována vytvořením vodivého stínítka naprašováním kovu nebo grafitu na jeho nepracující část [22] .

Centrifugaci lze použít k plnění vícekanálových mikroelektrod elektrolytem a roztoky testovaných látek .

Příprava vícekanálových mikroelektrod je technicky obtížná; to bylo argumentoval, že jejich výroba je jak hodně umění jak to je věda [23] .

Kompozitní mikroelektrody

Používají se ke stejným účelům jako vícekanálové. Kompozitní mikroelektrody poškozují buňku silněji, ale jejich elektrické vlastnosti často předčí vícekanálové. Sebráno ze samostatných mikroelektrod, kontrola práce pod mikroskopem [22] .

Plovoucí mikroelektroda

Plovoucí mikroelektrody navržené Woodburym a Bradym [24] se používají k záznamu elektrické aktivity buněk v kontraktilních tkáních, například myokardu . Mají odlehčenou konstrukci, s velmi krátkou válcovou částí a jsou upevněny na tenkém stříbrném nebo wolframovém drátu s kapkou laku. Pomocí mikromanipulátoru se elektroda přivede na povrch tkáně a spustí se na ni. Vstřikuje se do tkáně pod vlivem vlastní hmotnosti; když elektroda vstoupí do článku, je zaznamenán skok napětí.

Díky pružnosti drátu se elektroda může pohybovat spolu s tkání, do které je vložena. V praxi je možné ponechat elektrodu v cele několik minut. .

Mikropipety pro záplatovací svorky

Zesilovače pro práci se skleněnými mikroelektrodami

Biopotenciální zesilovače používané se skleněnými mikroelektrodami by měly mít následující vlastnosti [25] :

Pro práci s metodou patch clamp se používají specializované zesilovače.

Viz také

Poznámky

  1. ↑ 1 2 Kamkin, 2011 , str. 26.
  2. ↑ Hamill OP, Marty F., Neher E. et al. Vylepšené techniky patch-clamp pro záznam proudu s vysokým rozlišením z buněčných a bezcekk membránových záplat // Europ. J Physiok. - 1981. - Sv. 391(2) str. 85-100.
  3. ↑ Kožečkin, 1975 , s. 63.
  4. ↑ 1949, G. Ling & RW Gerard, Normální membránový potenciál vláken sartoria žáby, in: J. Cell. Comp. Physiol., 34, str. 383-96.
  5. ↑ Nastuk WL, Hodgkin AL (1950). „Elektrická aktivita jednotlivých svalových vláken“. J. Cell. Comp. fyziol. 35:39-73
  6. ↑ Nastuk WL Elektrická aktivita svalové buněčné membrány na neuromuskulárním spojení - J. Cellular Comp. fyziol. — v. 42, str. 249-272, 1953
  7. ↑ Kostyuk Platon Grigorievich // Velká sovětská encyklopedie  : [ve 30 svazcích]  / kap. vyd. A. M. Prochorov . - 3. vyd. - M  .: Sovětská encyklopedie, 1969-1978.
  8. ↑ O studiích G. A. Kurelly a Litvina F. F. - Kondrashin A. A., Samuilov V. D. Slunce - energie - život. // Teorie evoluce, jak je archivována 19. července 2011 na Wayback Machine .
  9. ↑ [1] Archivováno 13. února 2018 na Wayback Machine Warner Instruments PMP-102 je mikroprocesorem řízený stahovák.
  10. ↑ Shanes AM  - Elektrochemické aspekty fyziologického a farmakologického působení v excitabilních buňkách - Pharmacol. Revs., v. 10, str. 59-164, 1958
  11. ↑ Goffman B., Cranefield P. Elektrofyziologie srdce. — Překlad z angličtiny. Tsuzmer E.S. ed. Babský E. B. - M .: Nakladatelství zahraniční literatury - 1962
  12. ↑ Tasaki I., Tsukahara Y., Ito S., Wayner MJ, Yu WY Jednoduchá, přímá a rychlá metoda plnění mikroelektrod. — Fyziol. Behav., 1968, v. 3, str. 1009-1010.
  13. ↑ Kamkin, 2007 .
  14. ↑ 1 2 Velký workshop o fyziologii: učebnice. příspěvek na studenty. vyšší učebnice instituce / A. G. Kamkin a další M.: Izd. Centrum "Akademie" 2007.
  15. ↑ Kožečkin, 1975 , s. 82.
  16. ↑ Kamkin, 1989 , str. 108.
  17. ↑ Kamkin, 2011 , str. 32.
  18. ↑ Kamkin, 1989 , str. 112.
  19. ↑ Kamkin, 2011 , str. 33.
  20. ↑ Kamkin, 2011 , str. 34.
  21. ↑ Kožečkin, 1975 , s. 76.
  22. ↑ 1 2 3 Alexandrov A. A. Metoda mikroelektroforézy ve fyziologii. - L .: Nauka, 1983. - 148 s. — (Metody fyziologického výzkumu).
  23. ↑ Kelly JS Mikroiontoforetická aplikace léků na jednotlivé neurony. - In: Příručka psychofarakologie. New York; Londýn, 1975, v. 2, str. 29-67
  24. ↑ Woodbury JW, Brady AJ Intracelulární záznam z Moving Tissues with a Flexible Mounted Microelectrode - Science, 123, str. 100-101, 1956
  25. ↑ Kamkin, 2011 , str. 43.

Poznámky

  1. ↑ S určitými zjednodušeními lze rychlost difúze (mol/s) odhadnout následovně: , kde  je koncentrace elektrolytu,  je difúzní koeficient,  je polovina vnitřního úhlu hrotu elektrody, konstantní pro tento typ elektrody,  je vnitřní poloměr piercingové špičky. To znamená, že rychlost difúze je přímo úměrná tloušťce propichovacího hrotu a koncentraci elektrolytu vyplňujícího mikroelektrodu.

Literatura