Terapeutická angiogeneze (také nazývaná biologický shunting ) je taktika stimulace tvorby nových krevních cév pro léčbu nebo prevenci patologických stavů charakterizovaných snížením této funkce [1] .
Potřeba terapeutické angiogeneze se soustřeďuje do oblasti distálních forem chronické ischemie dolních končetin (CLLI), ischemické choroby srdeční , infarktu myokardu , u kterých jsou chirurgické metody léčby buď nemožné nebo dostatečně účinné, spojené s vysokou frekvencí kontraindikací a komplikací [2] [3] .
Koncept terapeutické angiogeneze se začal rozvíjet po práci J. Folkmana , který vypracoval teorii o vývoji a udržování dostatečného krevního zásobení pomocí angiogenních růstových faktorů v nádorových tkáních.
Po identifikaci růstových faktorů krevních cév začali vědci testovat hypotézy o stimulaci angiogeneze při léčbě ischemických stavů. Poprvé v klinické praxi byla terapeutická angiogeneze použita J. Isnerem. V roce 1994 byl 71letému pacientovi ve vážném stavu s kritickou ischemií dolních končetin (CLLI), IV . 5] .
Dalším klinickým výzkumníkem byl I. Baumgartner, který provedl řadu studií u pacientů s CLLI, popsal a klasifikoval možné nežádoucí účinky [6] .
Obvykle existují dva procesy, které jsou základem terapeutické angiogeneze: angiogeneze a vaskulogeneze [7] .
Vaskulogeneze je proces in situ tvorby krevních cév z endoteliálních progenitorových buněk (EPC), které migrují a fúzují s jinými endoteliálními progenitorovými buňkami do kapilár a diferencují se na endoteliální buňky za vzniku nových cév. Tato forma je nejčastější v embryonálním období [8] .
Angiogeneze zahrnuje prodlužování již vytvořených cév a je procesem pučení nových kapilár, včetně aktivace endoteliálních buněk, degradace extracelulární matrix, proliferace a migrace endoteliocytů a tvorby primárních vysoce permeabilních cévních struktur. Následně dochází ke stabilizaci a „dorůstání“ primárních vaskulárních struktur díky náboru buněk jiného typu: pericytů a buněk hladkého svalstva, což vede k organizaci komplexní trojrozměrné vaskulární sítě [8] .
Hlavním stimulačním faktorem angiogeneze za fyziologických a patologických podmínek je nedostatek kyslíku. Hypoxie stimuluje tvorbu většiny angiogenních faktorů a především hlavního regulátoru angiogeneze v embryonálním i postnatálním období vývoje organismu – vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) a jeho receptorů (VEGF-R). Bylo identifikováno více než 20 faktorů, které stimulují nebo inhibují proces angiogeneze (tabulka 1). Některé faktory v závislosti na dávce mohou být jak induktory angiogeneze, tak inhibitory [9] [10] . V současné době termín „terapeutická angiogeneze“ zahrnuje oba výše popsané procesy pro růst nových krevních cév [11] [12] [13] .
Tabulka 1 - "Induktory a inhibitory angiogeneze"
Induktory angiogeneze | Inhibitory angiogeneze |
---|---|
Vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) Fibroblastový růstový faktor (FGF) |
Endostatin Vasostatin |
Pro proces terapeutické angiogeneze se používají různé terapeutické přístupy:
Vědci, kteří podrobně znají fyziologické účinky vaskulárního endoteliálního růstového faktoru a mají pozitivní zkušenosti s používáním proteinových faktorů stimulujících hematopoézu, syntetizovali proteinové molekuly vaskulárního endoteliálního růstového faktoru a základního fibroblastového růstového faktoru (bFGF).
První nekontrolované klinické studie u pacientů s onemocněním koronárních tepen a pacientů s kritickou ischemií dolních končetin (CLLI) s použitím rekombinantních proteinů ukázaly povzbudivé předběžné výsledky, pokud jde o účinnost. Údaje z dvojitě zaslepených, placebem kontrolovaných studií však byly méně optimistické. Dvě velké studie, které testovaly intrakoronární podávání rekombinantních růstových faktorů (VEGF ve studii VIVA u 178 pacientů s ICHS, kteří nebyli optimálními kandidáty pro chirurgickou nebo endovaskulární revaskularizaci; FGF-2 ve studii FIRST u 337 podobných pacientů), nedokázaly najít rozdíly mezi výsledky ve skupinách s placebem.
Ve studii TRAFFIC (FGF-2 byl podáván dvakrát do stehenní tepny u pacientů s CLLI), ve které došlo k výraznějšímu prodloužení doby bezbolestné chůze u těch, kteří dostávali FGF-2 v prvních 3 měsících. vyrovnal po 6 měsících. zvýšením doby chůze bez bolesti ve skupině s placebem. Výsledky této studie však vyvolaly určitý optimismus ohledně možnosti použití rekombinantního FGF-2 v CLLI.
Je možné, že neúspěch kontrolovaných studií terapeutické angiogeneze s použitím rekombinantních růstových faktorů byl způsoben nesprávně zvoleným způsobem zavedení faktoru. Rekombinantní proteiny mají krátký poločas v krevním řečišti, navíc bylo prokázáno, že při intravaskulární cestě podání je velmi malá část proteinu zadržena v myokardu (0,1 % pro intravenózní podání a 5 % pro intrakoronární podání ). Pro efektivní využití rekombinantních růstových faktorů je nutné je zavádět lokálně do myokardu nebo kosterního svalstva ve formě komplexů s matrix proteiny, které zajišťují dlouhodobé lokální uvolňování faktoru [14] .
Tvorba nových cév je v současnosti považována za dva vzájemně související procesy – angiogenezi a vaskulogenezi. Vaskulogeneze zahrnuje účast endoteliálních progenitorových buněk kostní dřeně (EPC), které se přesouvají do místa tvorby nových cév, kde se diferencují na endoteliální buňky již na svém místě. Nejprobádanější metodou buněčné terapie ischemických chorob končetin je stimulace uvolňování buněk EPCs do krevního řečiště, jejich izolace z krevního řečiště a zavedení do ischemické oblasti. Na základě analýzy preklinických a řady klinických studií lze dojít k závěru, že zavedení prekurzorů endoteliocytů nebo stimulace uvolňování prekurzorů endoteliálních buněk urychluje tvorbu kolaterálních cév a zároveň minimalizuje oblast ischemického poškození. Proces však vyžaduje speciálně vybavenou laboratoř a počet získaných buněk se obvykle liší.
Mechanismus angiogenního působení kmenových buněk (SC) odvozených z dospělého organismu zahrnuje pravděpodobně parakrinní účinky spojené se sekreční aktivitou buněk a jejich diferenciací na specifické vaskulární buňky, stejně jako fúzi s tkáňovými buňkami. Specifická váha každého z těchto mechanismů nebyla plně stanovena a experimentální data jsou spíše rozporuplná. Do značné míry je však stimulace neovaskularizace se zavedením SC způsobena jejich sekreční aktivitou. To potvrzuje i skutečnost, že nárůst počtu cév v myokardu experimentálních zvířat byl pozorován zavedením téměř všech typů buněk používaných pro buněčnou terapii: krvetvorných a mezenchymálních buněk kostní dřeně, EC prekurzorů (cirkulujících a kostní dřeně), buňky získané z pupečníkové krve a dokonce kosterní myoblasty [14] [15] .
Alternativou k rekombinantní proteinové terapii může být genová terapie . Převládají dva typy vektorových systémů, které se používají k dodání terapeutického genu do ischemické oblasti: plazmidy a rekombinantní adenoviry [16] .
Na rozdíl od rekombinantních proteinů působí genetické konstrukty v cílové tkáni jeden až několik týdnů a poskytují méně náhlé a delší zvýšení obsahu angiogenního faktoru, což zabraňuje častým a opakovaným injekcím, což zase zabraňuje senzibilizaci těla [14]. . V preklinických studiích na zvířatech prokázalo použití DNA plazmidů genovou expresi trvající od několika dnů do několika měsíců s poměrně nízkou pravděpodobností dalšího přenosu. Tato doba je považována za relativně krátkou ve srovnání s virovými vektory, což je bezpečnostní faktor pro přípravu na bázi plazmidového vektoru. Plazmidy jsou ničeny extracelulárně i intracelulárně nukleázami , což zajišťuje lokalizaci a časové omezení procesu. Během velkého počtu studií genové terapie pro stimulaci angiogeneze byly k dosažení maximální bezpečnosti a účinnosti použity především lokální injekce [17] .
Použití adenovirových vektorů se vyznačuje vysokou účinností přenosu genového materiálu. Je však třeba vzít v úvahu, že v lidském těle jsou často přítomny adenovirové protilátky, které snižují účinnost přenosu na úroveň 5 % - úroveň srovnatelnou s charakteristikou nevirového přenosu genu. Virový genový přenos také vyžaduje speciální opatření biologické bezpečnosti, která nejsou nezbytná pro nevirové vektory pro přenos genů. Otázky bezpečnosti se také odrážejí ve zvýšeném výskytu nežádoucích účinků v klinických studiích s adenovirovými vektory: přechodná horečka, zvýšený C-reaktivní protein, zvýšené jaterní enzymy a titry adenovirových protilátek [18] .
K realizaci informace obsažené v plazmidu nebo rekombinantním viru dochází jako výsledek syntézy proteinů. Syntéza probíhá tradičním způsobem ( přepis , překlad ). Tvorba angiogenního růstového faktoru způsobuje řadu fyziologických změn vedoucích k růstu nové cévy. Na procesu angiogeneze se podílí velké množství angiogenních faktorů, ale nejaktivnějším proangiogenním cytokinem je vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), který je také nejvíce studován jak v preklinických, tak v klinických studiích.
Proces růstu cév s jeho účastí lze popsat v následující sekvenci [11] :
Absence cévního řečiště v umístěných implantátech, stejně jako jeho nedostatečně rychlý vývoj a integrace s cévní sítí recipientní oblasti, je jedním z nejdůležitějších problémů spojených s „selháním“ implantátu „fungovat“. Řešení problému vaskularizace umělých implantátů se vyvíjí dvěma způsoby: 1 - vytvoření podmínek pro aktivní vaskularizaci po implantaci pomocí různých bioinženýrských struktur (s využitím růstových faktorů, kmenových buněk); 2 - vytvoření cévní sítě před implantací do těla in vitro [19] .
K angiogenní modifikaci ( vitalizaci ) syntetických vláknitých materiálů se používají přípravky pro genovou terapii na bázi plazmidů kódujících vaskulární endoteliální růstové faktory [7] . Takto modifikované genově aktivované materiály se používají k vytvoření vaskularizovaných matric bioinženýrských orgánů a tkání [7] [20] .
Při požadavku na publikace v databázi týkající se terapeutické angiogeneze a růstových faktorů byly získány následující statistiky:
Typ požadavku | Počet citovaných výsledků |
---|---|
Terapeutická angiogeneze VEGF | 7 962 |
Terapeutická angiogeneze FGF | 406 |
Terapeutická angiogeneze HGF | 278 |
V klinické studii dominují konstrukty genové terapie nesoucí gen VEGF. Tabulka č. 2 odráží hlavní studie provedené a probíhající s těmito prototypy léčiv.
Tabulka 2. Klinické studie konstruktů genové terapie s genem VEGF
Gen | Choroba | Vektor | Cesta podání | Výsledek | Název studie | Literární pramen |
---|---|---|---|---|---|---|
VEGF-A 165 | HINK (včetně KINK) | DNA plazmid | Intramuskulární | Zlepšení perfuze | osmnáct | |
VEGF-A 165 | ischemická choroba srdeční | DNA plazmid | Intramyokardiální prostřednictvím minitorakotomie | Zlepšení perfuze | 19-23 | |
VEGF-A 165 | ischemická choroba srdeční | DNA plazmid | Zavedení do dutiny srdce katetrem | Zlepšení perfuze | 24 | |
VEGF-A 165 | ischemická choroba srdeční | DNA plazmid | Zavedení do dutiny srdce katetrem | Žádný rozdíl od placeba | EUROINJECT-ONE | 25.26 |
VEGF-A 165 | ischemická choroba srdeční | DNA plazmid | Zavedení do dutiny srdce katetrem | Žádný rozdíl od placeba | SEVERNÍ | 27 |
VEGF-A 165 | ischemická choroba srdeční | DNA plazmid | Intramyokardiální | Zlepšená perfuze a srdeční funkce | GENESIS I | 28 |
VEGF-A 165 | HINK (včetně KINK) | DNA plazmid | Intramuskulární | Selhání na hlavním a koncovém indikátoru (amputace). Zlepšení klinického výkonu. | 29 | |
VEGF- Ai65 //FGF-2 | ischemická choroba srdeční | DNA plazmid | Zavedení do dutiny srdce katetrem | Žádné zlepšení perfuze; malý klinický přínos | VIF-CAD | třicet |
VEGF-A 165 | HINK (včetně KINK) | DNA plazmid/lipozom nebo adenovirový vektor | Intraarteriální po perkutánní transluminální angioplastice | Krátkodobě zlepšení prokrvení, v 10. období sledování nejsou rozdíly v počtu amputací a jiných nežádoucích příhod | 31 | |
VEGF-A 165 | ischemická choroba srdeční | DNA plazmid/lipozom nebo adenovirový vektor | Intraarteriální po perkutánní koronární intervenci | Zlepšená perfuze v krátkodobém horizontu; v 8. období sledování nejsou rozdíly v počtu úmrtí a jiných nežádoucích příhod | KOČKA | 32 |
VEGF-A 121 | HINK (včetně KINK) | Adenovirový vektor | Intramuskulární | Žádný efekt | VZTEKAT SE | 33 |
VEGF-A 121 | ischemická choroba srdeční | Adenovirový vektor | Intramyokardiální během bypassu koronární tepny nebo minitorakotomie | Perfuze bez zlepšení; klinické zlepšení | REVASC | 34,35 |
VEGF-A 121 | ischemická choroba srdeční | Adenovirový vektor | Zavedení do dutiny srdce katetrem | Předčasně ukončeno – neúčinné | NOVA | 36 |
VEGF-D | ischemická choroba srdeční | Adenovirový vektor | Zavedení do dutiny srdce katetrem | CAT301 | http://clinicaltrials.gov/show/NCT01002430 | |
VEGF-D | Arteriovenózní přístup u pacientů na hemodialýze | Adenovirový vektor | Vektor je injikován do kolagenové smyčky | Zrušeno | AdV VANTAGE | http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00895479 |
Protein se zinkovým prstem, promotor VEGF-A | HINK (včetně KINK) | DNA plazmid | Intramuskulární | http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00080392 | ||
Protein se zinkovým prstem, promotor VEGF-A | Amyotrofní laterální skleróza | DNA plazmid | Intramuskulární | http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00748501 | ||
Protein se zinkovým prstem, promotor VEGF-A | Diabetická polyneuropatie | DNA plazmid | Intramuskulární | http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01079325 | ||
VEGF-A 165 | Diabetická polyneuropatie | DNA plazmid | Intramuskulární | Symptomatické zlepšení | 37 |
Zkratky: IHD — ischemická choroba srdeční; HINK - chronická ischemie dolních končetin; KINK - kritická ischemie dolních končetin
První a jediný lék pro genovou terapii pro terapeutickou angiogenezi byl zaregistrován v Rusku v roce 2011 (datum Republiky Uzbekistán −28.09.2011). Lék je plasmidová superspirálová deoxyribonukleová kyselina pCMV-VEGF165 kódující lidský vaskulární endoteliální růstový faktor. Indikace pro použití léku: v komplexní terapii revaskularizace při ischemii dolních končetin aterosklerotického původu (IIa-III stupeň podle A.V. Pokrovského-Fonteina).
Droga vstoupila na trh pod obchodním názvem „ Neovasculgen “. Podává se lokálně, intramuskulárně, co nejblíže ischemické oblasti a stimuluje rozvoj kolaterálního oběhu. [2, 38, 39]
Podle výsledků klinických studií ruského léku lze zaznamenat následující klinické rysy terapeutické angiogeneze:
Tabulka 3. Výsledky použití léku na bázi nukleové kyseliny (Neovasculgen) kódující VEGF v komplexní konzervativní terapii [17] .
Index | Základní linie | 90 dní (n=44) | 1 rok (n=39) | 2 roky (n=19) | |||
Absolutní hodnota | Trend (%) | Absolutní hodnota | Trend (%) | Absolutní hodnota | Trend (%) | ||
DBH (m) | 125±17,6 | 302±223* | ↑140,4 | 551±432* | ↑338,7 | 826,3±654* | ↑560.8 |
PoI | 0,54±0,16 | 0,62±0,14 | ↑15 | 0,65±0,15* | ↑20.4 | 0,54±0,2* | |
TcPO2 mmHg Umění. | 63±19 | 76±7* | ↑21 | 77,6±6* | ↑23.2 | 88,2±9* | ↑40 |
* statisticky významné rozdíly ve srovnání s výchozí hodnotou (p≤0,05, neparametrický Wilcoxonův test).
Při hodnocení dynamiky ukazatelů s přihlédnutím k počátečnímu stupni ischemie bylo zjištěno, že pro všechny skupiny pacientů (IIA, IIB, III. stadium ischemie) je charakteristická přetrvávající pozitivní dynamika. Vzdálenost bezbolestné chůze se tak ve větší míře prodloužila u středně těžké a těžké ischemie, o čemž svědčí nárůst o 90 dní. o 160 % a 173 % s IIB a III čl. ischemie, resp. Zdá se velmi významné, že ABI u nejzávažnější skupiny pacientů vzrostlo o více než 0,1 z úrovně 0,33±0,08 na 0,46±0,07 po 90 dnech. a až 0,48±0,1 za rok. Stejný trend byl pozorován z hlediska TcPO2 – u těžších pacientů byla zaznamenána výraznější odpověď na terapii (nárůst o 35,2 % po 90 dnech a o 32,5 % po roce).
Tabulka 4. Výsledky použití léku na bázi nukleové kyseliny (Neovasculgen) kódující VEGF v komplexní konzervativní terapii [21] .
Období pozorování | DBH, m | PoI | T s R O2 mm. rt. Umění. | |||||||
2a | 2b | 3 | 2a | 2b | 3 | 2a | 2b | 3 | ||
Základní linie | Absolutní hodnota | 293,5±132 (n=7) |
107,85±2,2 (n=24) |
48,35±2,7 (n=13) |
0,83±0,05 (n=7) |
0,58±0,09 (n=24) |
0,33±0,08 (n=13) |
77,3±6,3 (n=3) |
72,8±4,8 (n=24) |
54±16 (n=13) |
90 dní | Absolutní hodnota | 708±492 * (n=7) |
280,3±136,5 * (n=24) |
132±58,5 * (n=13) |
0,86±0,03 (n=7) |
0,63±0,1 (n=24) |
0,46±0,07 * (n=13) |
82,7±6,2 (n=3) |
83±3 * (n=24) |
73±11 * (n=13) |
Trend, % | ↑141.2 | ↑160 | ↑173 | ↑3.6 | ↑8.6 | ↑39.4 | ↑6.9 | ↑14 | ↑35.2 | |
1 rok | Absolutní hodnota | 1195,5±585 * (n=7) |
367,35±285,9 *' n=23) |
215±152 * (n=9) |
0,86±0,13 * (n=7) |
0,65±0,16 (n=23) |
0,48±0,1 * (n=9) |
83,1±5,9 (n=3) |
84,74±5,2 * (n=23) |
71,53±13 * (n=9) |
Trend, % | ↑307.3 | ↑243.3 | ↑344 | ↑3.6 | ↑12 | ↑45.5 | ↑7.5 | ↑16.4 | ↑32.5 |
* statisticky významné rozdíly od výchozí hodnoty
' statisticky významné rozdíly mezi 90 dny. a 1 rok (p≤0,05, neparametrický Wilcoxonův test).