| TEV proteáza | |
|---|---|
| Identifikátory | |
| Kód KF | 3.4.22.44 |
| Číslo CAS | 139946-51-3 |
| Enzymové databáze | |
| IntEnz | pohled IntEnz |
| BRENDA | Vstup BRENDA |
| ExPASy | NiceZyme pohled |
| MetaCyc | metabolická dráha |
| KEGG | Vstup do KEGG |
| PRIAM | profil |
| Struktury PNR | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsoučet |
| Vyhledávání | |
| PMC | články |
| PubMed | články |
| NCBI | NCBI proteiny |
| CAS | 139946-51-3 |
| Mediální soubory na Wikimedia Commons | |
TEV proteáza (z anglického Tobacco Etch Virus - virus gravírování tabáku ) je vysoce specifická cysteinová proteáza viru gravírování tabáku. Patří do PA superrodiny proteáz podobných chymotrypsinu. Díky své vysoké sekvenční specifitě se často používá pro řízené štěpení fúzních proteinů in vitro a in vivo . [jeden]
Celý genom viru tabáku etch kóduje jeden masivní polyprotein (350 kDa), který je štěpen na funkční bloky třemi proteázami: P1 proteáza (1 místo štěpení), HC-Pro (1 místo štěpení) a proteáza TEV (7 míst štěpení). . [2] Nativní proteáza také obsahuje vnitřní místo samoštěpení. Toto místo se pomalu štěpí za účelem inaktivace enzymu (fyziologický důvod toho není znám).
Struktura proteázy TEV byla stanovena pomocí rentgenové krystalografie . [3] Enzym se skládá ze dvou β-válců a flexibilního C-konce, který vykazuje strukturní homologii s nadrodinou trypsinových proteináz (PA-klan, rodina C4 podle klasifikace MEROPS). [4] Navzdory homologii se serinovými proteázami (jako je trypsin , elastáza, trombin atd.), proteáza TEV využívá cystein jako katalytické místo [5] (stejně jako mnoho jiných virových proteáz).
Kovalentní katalýza probíhá prostřednictvím triády Asp-His-Cys rozdělené mezi dva β-válce (Asp je na β1 a His a Cys jsou na β2). [6] Substrát je držen v β-listu, který tvoří antiparalelní interakci s drážkou mezi dvěma válci a paralelní interakci s C-koncem. [7] Enzym tedy vytváří vazebný tunel kolem substrátu a interakce postranních řetězců zajišťují specifičnost. [3]
Přirozená sekvence štěpení byla nejprve stanovena zkoumáním míst štěpení v nativním polyproteinovém substrátu pro opakující se sekvenci. Konsenzuální sekvence pro nativní místo štěpení je ENLYFQ\S (kde '\' označuje štěpitelnou peptidovou vazbu). [8] Aminokyselinové zbytky substrátu jsou očíslovány od P6 do P1 před místem štěpení a P1' po excizi. První práce také hodnotila štěpení řady podobných substrátů, aby se určilo, jak specificky by enzym štěpil nativní sekvenci. [9] [10]
Studie následně použily sekvenování štěpitelných substrátů ze skupiny randomizovaných sekvencí k určení preferovaných vzorů. [11] [12] Ačkoli je ENLYFQ\S optimální sekvence, proteáza je více či méně aktivní na různých substrátech (tj. vykazuje určitou variabilitu). K nejúčinnějšímu štěpení dochází v sekvencích nejpodobnějších konsensu EXLYΦQ\φ, kde X je jakýkoli aminokyselinový zbytek, Φ je jakýkoli velký nebo středně velký hydrofobní zbytek a φ je jakýkoli malý hydrofobní nebo polární aminokyselinový zbytek.
Specificita je zajištěna velkou kontaktní plochou mezi enzymem a substrátem. Proteázy, jako je trypsin , jsou specifické pro jeden aminokyselinový zbytek před a po štěpitelné vazbě prostřednictvím mělké vazebné mezery s pouze jednou nebo dvěma kapsami, které vážou postranní řetězce substrátu. Naopak virové proteázy, jako je proteáza TEV, mají dlouhý C-koncový konec, který zcela uzavírá substrát a vytváří vazebný tunel. Tento tunel obsahuje sadu vazebných kapes, takže každý postranní řetězec peptidového substrátu (P6 až Pl') se váže na komplementární místo (C6 až Cl'). [3]
Konkrétně peptidový postranní řetězec P6-Glu kontaktuje síť tří vodíkových vazeb; P5-Asn ukazuje na rozpouštědlo bez vytváření specifických interakcí (z tohoto důvodu neexistuje konsenzus o sekvenci substrátu v této poloze); P4-Leu se ponoří do hydrofobní kapsy; P3-Tyr je držen v hydrofobní kapse s krátkou vodíkovou vazbou na konci; P2-Phe je také obklopen hydrofobními zbytky, včetně povrchu histidinové triády; P1-Gln tvoří čtyři vodíkové vazby; a P1'-Ser je pouze částečně uzavřen v mělké hydrofobní drážce. [3]
Jedním z hlavních použití tohoto enzymu je odstranění afinitních značek z přípravků purifikovaných fúzních proteinů . Důvodem pro použití TEV proteázy jako biochemického nástroje je její vysoká sekvenční specificita. Díky tomu je in vivo relativně netoxický , protože sekvence, kterou rozpoznává, se v proteinech téměř nikdy nenachází. [13]
Ačkoli racionální design měl omezený úspěch při změně specificity proteázy, byla použita řízená evoluce ke změně preferovaného zbytku před [14] nebo za [15] [16] místem štěpení.
TEV proteáza má omezení ve svém použití. Je náchylný k deaktivaci samoštěpením, i když se tomu lze vyhnout mutací S219V na vnitřním místě štěpení [17] . Proteáza exprimovaná samostatně je špatně rozpustná; Bylo učiněno několik pokusů zlepšit jeho rozpustnost prostřednictvím řízené evoluce a počítačových simulací. Kromě toho se ukázalo, že expresi lze zlepšit fúzí s proteinem vázajícím maltózu , což zvyšuje rozpustnost partnera.
Molekulová hmotnost tohoto enzymu se pohybuje od 25 do 27 kDa v závislosti na použité konstrukci.