Chemické barevné reakce v mykologii

Chemické barevné reakce  - změna barvy různých makro- a mikroskopických struktur hub pod vlivem určitých chemických činidel . Chemická výzkumná metoda se používá při identifikaci vzorků hub k rozlišení taxonomických skupin. Taxonomickým znakem může být buď pozitivní nebo negativní výsledek testu, nebo variace ve změně barvy s pozitivními reakcemi, protože stejné činidlo může u různých druhů hub poskytovat různé barvy.

Pro zjištění charakteristických reakcí dužiny plodnice jako celku lze provést jednoduché testy , nebo mikroskopická vyšetření pro zjištění barevných reakcí hyf , spor , basidií a dalších prvků trama nebo mycelia . Studie lze provádět na čerstvě odebraných vzorcích hub a některé na herbářových vzorcích.

Význam a historie metody

Makroskopické znaky plodnic a někdy i znaky zjištěné při mikroskopickém vyšetření nemusí pro jednoznačnou definici stačit. V takových případech se jako dodatečné kritérium pro taxony používají barevné chemické reakce .

Analytická činidla používaná ve většině případů nejsou specifická pro určité látky nebo komplexy látek obsažených v houbách, ale často se ukazují jako specifická pro určité taxony hub, což umožňuje široké použití metody. Některé z použitých reakcí jsou specifické, např. pozitivní reakce s benzidinem a α-naftolem indikuje přítomnost enzymu lakázy v dužině houby , s fenol-tyrosinázou a amyloidní test umožňuje nejen stanovit přítomnost specifických polysacharidů ( glukanů ) v buňkách, ale také vyvodit určité závěry o struktuře jejich makromolekul.

Chemickou metodu poprvé použil v roce 1866 finský botanik William Nylander (1822-1899) pro taxonomii lišejníků . Nylander si všiml, že různé druhy reagují odlišně na vystavení roztokům zásad, chlornanů , jódu , solí železa a dalších činidel.

Müller později studoval účinky chemikálií na polyporézní houby a našel vzhled fialového zbarvení u Hapalopilus nidulans ; Harley objevil mizení fialové barvy dužiny černé mléčné houby působením alkálií. V průběhu 20. století se vlivem chemických činidel na houby zabývalo mnoho známých mykologů ( W. Meltzer , 1924; J. Schaeffer a F. Möller, 1938; R. Kühner a A. Romagnesi , 1953; R. Singer 1951, 1962, 1969, 1975, A. Meixner, 1975, S. P. Wasser , 1980, 1992). Nejúplnější údaje o chemických barevných reakcích basdiálních hub obsahují práce Küner a Romagnesi, Singer (1975), Meixner, Wasser. U lišejníků se chemickou metodou ve 30. letech 20. století do hloubky zabýval japonský mykolog Ya.Asahina [1] a podrobně ji popsal A. N. Oksner . [2]

Co se týče samotné chemické metody, existují mezi mykology dva protichůdné názory:

• Pouze na základě chemických reakcí jsou popisovány nové taxony, někdy i rody, přičemž jiná kritéria se vůbec neberou v úvahu, zejména podmínky pro růst hub.
• Někteří vědci nepřikládají metodě důležitost jako dodatečnému kritériu pro taxony.

S. P. Wasser [3] uvádí dva citáty charakterizující oba existující přístupy:

Čas od času dochází k pokusům o použití chemických pokusů k určení druhů hub a lišejníků, což často vyvolává bouři protestů. V těžko zařaditelné skupině, jejíž počet postav je malý nebo naopak velmi různorodý, je však třeba doplňující informace jen uvítat.

Chemická metoda, jako jedna z nejpohodlnějších, nejrychlejších a nejspolehlivějších, protože poskytuje další informace v úsudcích o druzích a dalších taxonech, by měla být široce používána, ale bezesporu spolu s dalšími taxonomickými metodami, zejména morfologickými.

Běžně používaná činidla

Výsledky studie jsou často psány v souhrnné formě pomocí chemických vzorců (pro anorganická činidla) nebo zkratek, které se mohou lišit od autora k autorovi, takže seznamy konvencí jsou uvedeny v publikacích. V závislosti na použitelnosti reakce na danou taxonomickou skupinu může být hlášen pouze pozitivní nebo negativní výsledek (například položka "KOH+"/"KOH-" znamená pozitivní/negativní reakci s alkálií) nebo může dojít ke změně barvy. (například "KOH+ zežloutne"). Označuje se i část plodnice nebo určitá mikrostruktura, pokud není působení činidla pro různé struktury houby stejné [6] [7] .

• Amoniak NH 3 nebo NH 4 OH (25% vodný roztok nebo pára amoniaku ) u agarických hub dává zelené, méně často žluté zbarvení [8] , u jiných bazidiomycetů se může objevit narůžovělé, olivové, fialové, šedočerné zbarvení [9 ] . V lichenologii se používá zřídka [10] .
• Anilin C 6 H 5 NH 2 se používá v čisté formě nebo ve formě 50% vodné emulze, zkráceně „A“. Když je pozitivní u bazidiomycet, produkuje načervenalé, měděně červené, žluté, žlutooranžové, tmavě hnědé nebo olivové zbarvení [9] [3] .
• Aromatické diaminy
  • Benzidin 4,4'-(C 6 H 4 NH 2 ) 2 ve formě alkoholového roztoku dává modré zbarvení, což ukazuje na přítomnost lakázy . Činidlo je silný karcinogen , proto je v praxi nahrazováno ortho -tolidinem (dimethylbenzidinem), který je mnohem méně nebezpečný a dává stejnou reakci, jaká byla ukázána v práci H. Clemensona [Clemençon, Schweiz. Zeitschr. f. Pilzk., 1969, 47]. [3]
  • para - Fenylendiamin 1,4-C6H4(NH2)2lze označovat jako P nebo Pd, používá se jako 2% alkohol nebo 1% vodný roztok, v roce 1934 bylo toto činidlo zavedeno do lichenologické praxe I Asahina . V přítomnosti vzdušného kyslíkup-fenylendiaminu rychle oxidují a stávají se nepoužitelnými, proto se před použitím kontrolují na vzorku „jeleního mechu“ Cladonia rangiferina , který dává intenzivní červenou barvu. K ochraně činidla před oxidací se do vodného roztoku přidásiřičitan sodný. Takový roztok, nazývanýSteinerovo činidlo, vydrží mnohem déle [10] .
• Guajakol (lihový roztok nebo tinktura ze semen rostliny Guajacum officinale ) dává modrozelené, modrošedé, olivové nebo červenohnědé zbarvení.
• Koncentrované roztoky kyselin mohou vyvolat různé barevné reakce, používají se na čerstvý materiál:
  • 60-70% kyselina sírová ,
  • 65% kyselina dusičná ,
  • 25% kyselina chlorovodíková ,
  • Kyselina mléčná .
• Laktofenol  je směs stejných dílů kyseliny mléčné a fenolu , s pozitivní reakcí dává barvu hnědé, růžovofialové, lila, načervenalé odstíny.
• Kyselina karbolová (2,5% roztok fenolu ) dává načervenalou, nažloutlou, hnědou nebo fialovou barvu. Reakce je považována za pozitivní, pokud se barva objeví do 20 minut.
• α-Naftol (vodo-lihový roztok) se barví do fialova nebo do červena, reakce probíhá za 2-4 minuty.
• Pyramidon (vodný roztok) dává reakci s barvením v lila-fialové barvě.
• Pyrogalol (roztok alkoholu) se barví hnědě.
• Sulfovanilin  - roztok 1 g vanilinu ve směsi 8 ml koncentrované kyseliny sírové a 3 ml destilované vody na čerstvém materiálu dává fialové, hnědé, růžovofialové zbarvení. Poprvé jej použili Arnold a Goris v roce 1907 .
• Sulfoformalin  je směs formalínu a 60-70% kyseliny sírové. Používá se na čerstvý materiál a na vzorky skladované ve formalínu nejdéle 6 měsíců. Při pozitivní reakci se pomalu objevuje hnědá barva.
• Fenolanilin  - směs 3 kapek anilinu , 5 kapek koncentrované kyseliny sírové a 10 ml kyseliny karbolové. Pozitivní reakcí je výskyt rezavě růžové, purpurově červené nebo lila růžové barvy, která následně přechází do čokoládově hnědé.
• Formalín barví fialově hnědé nebo načervenalé.
• 10% roztok chloridu železitého dává nazelenalou barvu, poté přechází do tmavě šedé barvy.
• 10% roztok síranu železnatého s přídavkem kyseliny sírové barví dužinu zeleně, olivově, oranžově nebo hnědě.
• Alkalické roztoky ( hydroxid draselný nebo sodný ) dávají růžovou, žlutou, červenohnědou nebo oranžovou barvu, reakce je vhodná i pro herbářový materiál. Zčernání hnědé dužiny některých hub působením alkálie se nazývá xantochroidní reakce [11] .

Jiné techniky

Amyloidní test

Amyloid je schopnost struktur barvit se působením roztoků jódu . Obvykle se používá Meltzerovo činidlo : stejný objem chloralhydrátu se přidá k vodnému roztoku obsahujícímu 2,5 % jódu a 7,5 % jodidu draselného . Reakce se používá jako makroskopická a pro barvení preparátů pod mikroskopem, což umožňuje stanovit amyloiditu různých struktur: spor, hyfy , basidium . Amyloidita se projevuje i u vzorků, které byly delší dobu (více než 100 let) uloženy v herbáři (podle Singera, 1975) [8] . Přítomnost a stupeň amyloidity umožňuje určit strukturní vlastnosti molekul glukanu  - polysacharidů podobných škrobu , a také tloušťku glukanové vrstvy na povrchu mikroskopických struktur houby. Jód je adsorbován v případě silně vyvinuté povrchové vrstvy v kanálcích mezi glukanovými řetězci. Pokud jsou řetězce vysoce rozvětvené, reakce dává žlutohnědou barvu, v přítomnosti méně rozvětvených řetězců se objevuje samotná amyloidní reakce - intenzivní modrá, podobná reakci škrobového jodu známé v analytické chemii. Obvykle se rozlišují neamyloidní struktury (nebarví se), dextrinoidní nebo pseudoamyloidní ( barva ve žlutých a hnědých tónech) a amyloidní (barva v modré, modré až téměř černé) [12] .

V. A. Spirin a spoluautoři [13] v roce 2005 navrhli určit stupeň gradace této reakce v souladu s barevnou škálou (v závorce - barevné označení podle škály J. Petersena [Petersen, 1996]):

• mírně dextrinoidní - světle hnědá (P14) až světle olivová (P16)
• dextrinoid - žlutohnědý (P9)
• silný dextrinoid - oranžovo-hnědý (P7)
• nevýrazný amyloid - světle myší šedá (P53) až světle fialově šedá (P59)
• slabý amyloid – myší šedá (P55)
• amyloid – modrošedá (P57) až tmavě modrošedá (P56)
• silně amyloidní - vínová (P58) až šedavě fialová (P44)

Schaefferova reakce

Schaefferova křížová reakce : na řez se nanese skleněnou tyčinkou proužek anilinového roztoku a poté se křížením proužek 65% kyseliny dusičné. Při pozitivní reakci se na křižovatce objeví chromově žlutá skvrna, poté se barva změní na oranžově červenou. Schaefferova reakce je důležitým intragenerickým znakem pro rod Agaricus . Vhodné pro materiál dlouhodobě uložený v herbáři. Objevil Yu.Sheffer v roce 1933 [8]

Aplikace barviv

Barvení organickými barvivy se používá jak ke zlepšení optických vlastností mikroskopických preparátů, tak k charakterizaci obarvených struktur. Například při barvení toluidinovými barvivy ( kresylová modř ) se rozlišuje cyanofilie  - namodralé zbarvení a metachromázie  - červenorůžové nebo červenofialové zbarvení.

Poznámky

1. ↑ Oxner, 1974 , str. 223.
2. ↑ Oxner, 1974 , str. 13-14, 209-225, 250-251.
3. ↑ 1 2 3 Vasser, 1980 , str. 44.
4. ↑ Vasser cituje z knihy. Zpěvák R. The Agaricales v moderní taxonomii. — Vaduz: Cramer, 1975.
5. ↑ Oxner, 1974 , str. 222.
6. ↑ Oxner, 1974 , str. 250.
7. ↑ Vasser, 1980 , s. 46-53 (tabulka).
8. ↑ 1 2 3 Wasser, 1980 , str. 54.
9. ↑ 1 2 Metody experimentální mykologie, 1982 , s. 474.
10. ↑ 1 2 Oxner, 1974 , str. 251.
11. ↑ Bondartseva M.A., Parmasto E.Kh. Families Hymenochetes, Lachnocladiae, Coniophora, Slitfoils. - L . : "Nauka", 1986. - S. 9. - (Klíč k houbám SSSR; Řád Aphyllophoraceae; číslo 1).
12. ↑ Zmitrovich, 2008 , s. 24.
13. ↑ W. A. ​​​​Spirin, IV Zmitrovič, V. F. Malysheva. Poznámky k Perenniporiaceae. -Svatý. Petersburg: Všeruský institut ochrany rostlin, 2005. - S. 9. - (Folia Cryptogamica Petropolitana. č. 3). ISSN 1810-9586

Literatura

• Oksner A.N. Morfologie, systematika a geografická distribuce. - L .: "Nauka", 1974. - 284 s. - (Klíč k lišejníkům SSSR. Vydání 2).
• Dudka I. A., Vasser S. P., Ellanskaya E. A. et al. Metody experimentální mykologie. Adresář. - Kyjev: "Naukova Dumka", 1982. - S. 59, 474-477.
• Wasser S.P. Flóra hub na Ukrajině. Houby Agaricus. - Kyjev: "Naukova Dumka", 1980. - S. 43-55.
• Zmitrovich I.V. Families Atelier a Amylocorticia . - M. - Petrohrad: Asociace vědeckých publikací KMK, 2008. - S.  24 -25. - (Klíč k houbám Ruska. Řád aphyllophoraceae; číslo 3). - ISBN 978-5-87317-561-1 .