Intracelulární třídění proteinů ( angl. protein sorting, protein targeting ) jsou procesy značení a následného transportu proteinů v živých buňkách, které vedou ke vstupu proteinů do určitých kompartmentů buňky.
Proteiny syntetizované v cytoplazmě na ribozomech musí vstupovat do různých buněčných kompartmentů - do jádra , mitochondrií , endoplazmatického retikula (ER), Golgiho aparátu , lysozomů a dalších[ co? ] a některé proteiny se musí dostat do vnější membrány nebo do extracelulárního prostředí. Pro vstup do konkrétního kompartmentu musí mít protein specifickou značku. Ve většině případů je taková značka součástí aminokyselinové sekvence samotného proteinu (vedoucí peptid nebo proteinová signální sekvence ). V některých případech slouží oligosacharidy posttranslačně připojené k proteinu jako značka.
Transport proteinů do ER probíhá tak, jak jsou syntetizovány, protože ribozomy, které syntetizují proteiny se signální sekvencí pro ER, „sednou“ na speciálních translokačních komplexech na membráně ER. Signální sekvence pro EPR obvykle zahrnuje 5-10 převážně hydrofobních aminokyselin a je umístěna na N-konci proteinu. V jeho vzdálené části je konsenzuální sekvence rozpoznávaná specifickou proteázou. Tato signální sekvence je rozpoznána speciálním komplexem – „částicí pro rozpoznávání signálu“ (signal-recognition partikule, SRP). SRP se skládá ze šesti proteinů a krátké molekuly 7SL RNA [1] . Jedna část SRP se váže na signální sekvenci, zatímco druhá se váže na ribozom a blokuje translaci. Samostatná doména SRP je zodpovědná za vazbu na receptor SRP na membráně ER.
Spolu se SRP se ribozom přesouvá do ER a váže se na SRP receptor (integrální protein) na cytosolové straně membrány ER. Tento komplex (ribozom - SRP - SRP receptor) se váže na pór - proteinový translokátor na membráně ER. Obvykle je několik ribozomů spojeno s mRNA a polyribozomy sedí na membráně ER, přičemž každý ribozom je připojen k vlastnímu póru. Po dosažení 3' konce mRNA se ribozom vrací do cytoplazmy, avšak mRNA zůstává zachována na ER membráně díky skutečnosti, že na její 5' konec jsou připojeny nové ribozomy vázané na SRP.
Po navázání na translokátor se komplex SRP-SRP receptoru oddělí od ribozomu a to vede k obnovení translace. Nyní bylo prokázáno, že protein, jak je překládán, vstupuje do ER vodním kanálem translokátoru, který má hradlový mechanismus a je tvořen v eukaryotech čtyřmi podjednotkami komplexu Sec61 (homologní proteiny se nacházejí i na bakteriálních buněčné membrány).
Po obnovení translace zůstává hydrofobní oblast signální sekvence spojena s translokátorem a nově syntetizovaný protein ve formě smyčky je zatlačen do ER. Tento proces nevyžaduje další výdej energie ATP. Poté, co se C-konec proteinu oddělí od ribozomu a ocitne se uvnitř ER, signální peptidová proteáza jej odřízne od proteinu. Protein uvnitř ER se složí, získá normální konformaci a signální peptid se přesune laterálním kanálem otevřeným v translokátoru do lipidové dvojvrstvy membrány ER, kde je rychle degradován proteázami.
Protein, který vstoupil do ER, zůstává v této organele, pokud má na C-konci speciální sekvenci čtyř aminokyselin zadržující ER. Některé ze zbývajících proteinů v ER hrají důležitou roli ve skládání a posttranslační modifikaci proteinů procházejících ER. Enzym disulfid isomeráza tedy katalyzuje oxidaci volných SH skupin cysteinu a tvorbu disulfidových vazeb, zatímco protein Chaperon BiP zabraňuje nesprávnému skládání a agregaci proteinů, dokud nevytvoří kvartérní struktury, a také podporuje retenci souvisejících proteinů. s tím na pohotovosti.
Podobný, ale složitější mechanismus zajišťuje kotranslační začlenění transmembránových proteinů do membrány ER.
Dochází také k posttranslačnímu transportu proteinů do ER (běžnější u kvasinek), při kterém se plně syntetizovaný protein naváže na chaperony v cytosolu a poté je přenesen do ER přes translokátor za účasti chaperonů rodiny Hsp70 . Tento typ transportu je závislý na ATP. Pro transport peptidů (převážně dlouhých 8–16 aminokyselin) z cytosolu do ER pro jejich následnou prezentaci v kombinaci s molekulami MHC-I existuje speciální translokátor, protein TAP.
Z EPR do Golgiho aparátu (AG) a odtud do lysozomů, do vnější membrány nebo do extracelulárního prostředí proteiny vstupují vezikulárním transportem . Většina proteinů, které vstoupily do dutiny ER, je glykosylována pomocí standardního oligosacharidu, jehož syntéza se provádí na membránách hrubého ER. Syntetizovaný oligosacharid je pyrofosfát navázaný na lipid dolichol, který jej ukotví v membráně, a je převeden na postranní aminoskupinu asparaginu enzymem oligosacharyltransferázou. Správné sbalení proteinů závisí na přítomnosti této oligosacharidové značky, protože jsou na ni (po její modifikaci) navázány kalciově závislé chaperony kalnexin a kalretikulin (což jsou oba lektiny ); zadržují neúplně sbalené proteiny v ER a zajišťují jejich interakci s jinými chaperony. Pokud se protein po nějakou dobu řádně nesvinul, pak je retranslokován zpět do cytosolu, zbaven oligosacharidu, ubikvitinylován a degradován v proteazomech . Pokud je protein správně složen, může se přesunout do AG nebo zůstat v ER.
Proteiny vstupují z ER do AG v ohraničených membránových váčcích, jejichž obal je tvořen z proteinu COP-II. Všechny správně složené proteiny spadají do takových vezikul "standardně" a přesunou se do AG a některé z nich se pak vrátí do ER. Proteiny se speciálními signálními značkami jsou však koncentrovány v transportních vezikulách, zatímco proteiny bez těchto značek se tam dostávají v malém množství. Vezikuly oddělené od ER, které ztratily své membrány, se spojují do tubulárních vezikulárních shluků, které se pomocí motorických proteinů pohybují podél mikrotubulů do AG. Z těchto shluků (stejně jako z cis-Golgiho) se oddělí vezikuly obalené proteinem COP-I, což zajišťuje reverzní transport rezidentních proteinů do ER. Návrat proteinů do ER zajišťuje krátká signální sekvence na jejich C-konci, která se váže buď přímo na COP-I (u membránových proteinů), nebo na specifický receptor, který interaguje s COP-I (u rozpustných proteinů). Proteiny postrádající tyto sekvence přednostně zůstávají v AG.
Uvnitř vezikul se proteiny postupně přesouvají z cis-Golgiho do trans-Golgiho. Jak se proteiny pohybují uvnitř AG, enzymy glykosyltransferázy modifikují své oligosacharidové „značky“. Pomocí takových enzymů v AG se syntetizují glykoproteiny - muciny a proteoglykany.
Membránové proteiny a trávicí enzymy lysozomů putují z trans-Golgiho váčků potažených klatrinem do časného endozomu a odtud do lysozomu . Aby lysozomální enzymy (kyselé hydrolázy ) vstoupily do lysozomů, musí mít na koncích oligosacharidových řetězců speciální značku - manóza-6-fosfátové zbytky. Tato značka se aplikuje ve dvou fázích. Nejprve v cis-Golgi enzym N-acetylglukosamin fosfotransferáza připojí zbytky N-acetylglukosamin fosfátu k oligosacharidům a poté v trans-Golgi druhý enzym odštěpí N-acetylglukosamin. Označení se aplikuje na ty proteiny, které mají specifické rysy terciární struktury - "signální tuberkul" (signální náplast). Poté jsou manóza-6-fosfáty rozpoznávány specifickým membránovým receptorem, na který jsou navázány hydrolázy. V endozomech se při poklesu pH oddělují hydrolázy od receptorů, které jsou jako součást speciálních váčků dodávány zpět do AG.
Mutace v genu N-acetylglukosamin fosfotransferázy vedou k rozvoji těžké formy mukopolysacharidózy , onemocnění I-buněk, při kterém jsou všechny lysozomové enzymy vylučovány do extracelulárního prostředí.
Transport proteinů z vnějšího prostředí do lysozomůI za normálních okolností se část lysozomálních enzymů uvolňuje z buňky a část membránových proteinů lysozomů vstupuje do její vnější membrány. Z extracelulárního prostředí mohou být lyzozomální enzymy vychytávány endocytózou a dodávány do lysozomů (viz [2] ).
Transport proteinů z cytoplazmy do lysozomůKromě vezikulárního transportu z AG existuje další způsob transportu proteinů do lysozomů. Během autofagie zprostředkované chaperony jsou tedy částečně denaturované proteiny transportovány z cytoplazmy přes membránu lysozomu do její dutiny, kde jsou štěpeny. Tento typ autofagie, popisovaný pouze u savců, je vyvolán stresem. Dochází k němu za účasti cytoplazmatických chaperonových proteinů rodiny hsp-70, pomocných proteinů a LAMP-2, který slouží jako membránový receptor pro komplex chaperonu a proteinu, který má být transportován do lysozomu. V buňkách prezentujících antigen (např. dendritické buňky ) může transport peptidů prezentovaných v komplexu s MHC-II probíhat přímo do lysozomů prostřednictvím TAPL translokátorového proteinu.
Proteiny vstupují do jádra jadernými póry . Jaderným pórem může být současně transportováno až 500 makromolekul v obou směrech. Proteiny (peptidy) s molekulovou hmotností až 5000 daltonů volně difundují jadernými póry. Pasivním transportem (difúzí) mohou póry pronikat proteiny o molekulové hmotnosti až 60 000 daltonů.
Větší bílkoviny jsou transportovány do jádra aktivně (s vynaložením energie). Aby se takové proteiny přesunuly do jádra, musí obsahovat určitou aminokyselinovou sekvenci - jaderný lokalizační signál . Transportní faktory, karyoferiny (importiny), jsou na tuto sekvenci vázány buď přímo, nebo pomocí adaptorových proteinů. Karyoferiny se také vážou na složky jaderných pórů. Energii pro transport poskytuje hydrolýza GTP malou monomerní GTPázou Ran. V cytoplazmě je Ran ve formě spojené s GDP, protože proteiny Ran-GAP (aktivátory aktivity GTPázy Ran) jsou lokalizovány v cytoplazmě a v jádře je Ran ve formě spojené s GTP, protože protein, který zajišťuje výměnu GDP je lokalizován v jádře.na GTF. Ran-GTP vazbou na „nabitý“ karyoferin na vnitřní straně jaderného póru zajišťuje jeho uvolnění. Receptor s připojeným Ran-GTP pak vstupuje do cytoplazmy, kde protein GAP způsobí hydrolýzu GTP a separaci Ran-GDP od karyoferinu.
Podobný mechanismus zajišťuje export proteinů z jádra, jen tyto proteiny musí mít jinou signální sekvenci – signál pro export z jádra, na který se exportiny vážou.
Proteiny s odpovídajícími signálními sekvencemi vstupují do mitochondrií a chloroplastů přes specifické póry proteinového translokátoru za účasti chaperonů .