Dvouhybridní analýza je molekulárně biologická metoda, která umožňuje vysoce přesnou detekci interakcí protein-protein a DNA-protein za podmínek in vivo .
Je založen na použití transkripčních faktorů sestávajících z fyzikálně a funkčně oddělitelných domén : DNA-vazebná ( vazebná doména, BD ) a aktivátorová doména ( aktivační doména, AD ). Fyzikální interakce dvou rekombinantních proteinů iniciuje fúzi transkripčních domén "zesíťovaných" s nimi, čímž se aktivuje exprese reportérových genů .
Metodu dvouhybridní analýzy poprvé popsali a použili S. Fields a O. Song v roce 1989 [1] při studiu transkripčního faktoru GAL4 v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae . Nicméně od té doby byl princip detekce interakcí protein-protein pomocí aktivátoru transkripce GAL4 přizpůsoben k vytvoření dalších alternativních metod, včetně některých schopných detekce interakcí DNA-protein a DNA-DNA, stejně jako multiproteinových komplexů.
Kromě kvasinek se používají také Escherichia coli [2] a savčí buňky .
Metoda dvouhybridní analýzy je založena na strukturních rysech promotorů genu GAL kódujících protein galaktozidázu . Promotory těchto genů se skládají z TATA boxu , sekvence aktivátoru UAS a iniciačního motivu Inr . Objevení se galaktózy v buňce vede ke konformačním změnám v regulačních proteinech , což umožňuje proteinu Gal4p začít působit jako aktivátor na různé promotory GAL [3] .
Transkripční aktivátor GAL4p je endogenně exprimovaný protein 881 a.a. dlouhý, obsahující 2 domény : DNA-vazebný (1-147 a.a.) a aktivátor (771-881 a.a.). V přirozených transkripčních faktorech jsou tyto domény součástí jedné proteinové globule, ale mohou být také syntetizovány samostatně, přičemž si zachovávají své původní funkce.
Jako příklad popisujeme zařízení klasické metody dvouhybridního systému používané k detekci interakcí mezi proteiny. Pro testování přítomnosti interakce mezi proteinem A a proteinem B se vytvoří rekombinantní molekuly , z nichž jedna je protein A fúzovaný s doménou vázající DNA (A-CD) a druhý je protein B fúzovaný s doménou aktivátoru ( ŠPATNÝ). Ve složení chimérických proteinů si domény zachovávají své funkce. Samostatně každá rekombinantní molekula není schopna vyvolat aktivaci transkripce , avšak v těsné blízkosti, pravděpodobně v důsledku interakce mezi proteiny A a B, je obnovena původní funkce proteinu GAL4p a je aktivován reportérový gen [4 ] [5] .
Kvasinkový dvouhybrinový screening často využívá geneticky modifikované kvasinkové kmeny , které postrádají biosyntézu určitých živin (typicky aminokyselin nebo nukleových kyselin ). Takové kmeny se nazývají auxotrofní . Při pěstování na médiu postrádajícím tyto živiny kvasinky zemřou. Dále jsou dva auxotrofní kmeny transfekovány plasmidy , ve kterých promotor galaktosidázy reguluje transkripci genu kódujícího chybějící prvek metabolické dráhy . Jeden plazmid bude také obsahovat gen pro protein A fúzovaný s SD. V tomto případě je protein A obvykle znám. Druhý plazmid bude obsahovat gen AD fúzního B proteinu. V tomto případě může být protein B buď proteinem s neznámou funkcí, je třeba ověřit možnost vazby na protein A, nebo místo jednoho plazmidu s genem fúzního proteinu B-AD může existovat celá knihovna různých plasmidy obsahující geny pro různé proteiny fúzované s AD. Knihovna proteinů je tedy testována na možnost interakce s proteinem A. Metody využívající knihovnu předpokládají, že do studované buňky vstupuje pouze jeden pár plazmidů, takže každá buňka neprodukuje více než jeden protein z knihovny. Poté se zkříží dva auxotrofní kmeny [2] . Ve výsledném hybridu se po úspěšné interakci mezi A a B domény AD a SD nepřímo spojí a AD je v těsné blízkosti místa začátku transkripce reportérového genu. Výsledný kmen nebude auxotrofní. Při absenci interakce nedochází k transkripci, hybrid je auxotrofen. Úspěšná interakce je tedy spojena se změnou buněčného fenotypu .
Dvouhybridní analýza nevyžaduje speciální drahé vybavení a umožňuje analýzu celých knihoven. Významnou nevýhodou této metody je však velké množství falešně pozitivních výsledků .
Tato metoda je založena na stejných principech jako dvouhybridní systém s tím rozdílem, že proteiny A a B spolu přímo neinteragují. Mezi nimi je třetí prvek - látka X. Touto látkou může být molekula DNA nebo RNA , malý organický ligand , inhibitor , který se kovalentně váže na aktivní centrum enzymu . Metoda umožňuje identifikovat interakce NK -proteinu, enzymatickou aktivitu ve vztahu k danému substrátu , interakci proteinu s malými molekulami [4] .
Hlavní rozdíl oproti „přímému“ dvouhybridnímu systému je zde v tom, že gen, jehož exprese je tímto systémem regulována, je letální. Pokud tedy dojde k interakci mezi proteiny A a B, hybridní organismus zemře. Tato metoda se používá ke stanovení aminokyselinových zbytků nezbytných pro interakci mezi globulemi A a B [4] .
V této modifikaci klasické metody existuje pouze jedna rekombinantní molekula, AD-A-B-SD. V tomto případě je známá sekvence DNA vložena před reportérový gen , BD se mění. Tímto způsobem je možné určit, které proteiny se vážou na danou sekvenci DNA [4] .
Předpokládá se, že k implementaci dvouhybridního systému lze použít jakoukoli živou buňku , nicméně existují praktické úvahy o nízké ceně a stabilitě vybrané buněčné linie [6] .
Historicky prvním organismem pro dvouhybridní systém jsou kvasinky . Kvasinky jsou stabilní, jednoduchý a dobře prozkoumaný modelový organismus . Buňky kvasinek si udržují neutrální hodnoty pH uvnitř buňky i přes kyselé hodnoty pH ve vnějším prostředí. Kvasinky jsou také slabě citlivé na extracelulární toxiny, lze s nimi manipulovat bez použití molekulárních metod [7] Je důležité si uvědomit potřebu jaderných lokalizačních signálů , protože celý genetický aparát kvasinek je lokalizován v jádře. V jejich nepřítomnosti nebude potenciálně interagující pár proteinů přeložen a nebude interagovat.
Bakteriální systémy lze použít podobně jako kvasinkové systémy. Mají zjevně větší potenciál a jsou vhodnější pro použití dvouhybridního systému. Bakteriální systémy umožňují použití a analýzu knihoven větších než 10 8 , mají vyšší rychlost růstu a větší potenciál pro propustnost malých molekul. Také není potřeba jaderných lokalizačních signálů a je možné studovat proteiny, které jsou toxické pro kvasinky. Díky rychlejším selektivním metodám je zajištěna nízká míra falešně pozitivních nálezů (3·10 −8 ) [6] .
Při studiu interakce proteinů je možné identifikovat nové funkce. Pomocí jednoho známého proteinu Ao , knihovny neznámých proteinů Bn a následného srovnání s dříve známým párem proteinů interagujících s A0B0 lze získat informace o podobnosti Bn a Bo . Podobná data lze získat studiem interakcí známé knihovny proteinů s jedním proteinem s neznámou funkcí [7] .
Dvouhybridní systém se používá, když je pro pár známých a interagujících proteinů nutné určit aminokyselinové zbytky , které tvoří oblast jejich interakce. K tomu se v použitých plazmidech provádějí mutace v párech bází DNA odpovídajících specifickým aminokyselinám . Vzniká tak knihovna s bodovými změnami aminokyselinových zbytků, na jejímž základě lze pomocí dvouhybridního systému určit význam konkrétní aminokyseliny při tvorbě interakce s partnerským proteinem [7 ] .
Moderní metody umožňují sestrojit buňku vybranou pro studium tak, aby odrážela ten či onen molekulární aspekt vybraný pro studium. V takových buňkách je možné testovat specifičnost a přesnost podávání léků zprostředkovaných dvouhybridním systémem, což vám umožní rychle vyřešit problémy vznikajících vedlejších účinků.
Podobný přístup se používá u toxinů a jedů [7] .
K hledání proteinů se zinkovým prstem (proteiny zinkových prstů nebo ZFP) byly úspěšně použity metody založené na dvouhybridní analýze [2] . Jako DNA-vazebný protein se ZFP používá k vytvoření nestandardních DNA-vazebných domén, které se koordinují s předem určenou oblastí sekvence DNA.
Metoda je založena na vytvoření knihovny ZFP náhodnou změnou určitých aminokyselinových zbytků. Dále se z nich vybírají ty, které jsou schopny interagovat s cílovým místem zahrnutým v UAS, odpovídající požadovaným charakteristikám. Každý ZFP však rozpoznává pouze malý úsek DNA, asi 3-4 báze, takže ke zlepšení přesnosti vazby a zabránění rozpoznání míst mimo UAS se používá komplex sestávající ze dvou ZFP s konstantní sekvencí . ZFP z takového komplexu se vážou na okrajích cílové oblasti a zabraňují vazbě mimo UAS [2] .
Pomocí tohoto systému lze také zkoumat řadu dalších vazebných domén DNA.