Calponin ( angl. Calponin ) je členem rodiny aktin-vazebných proteinů, typických především pro buňky hladkého svalstva , které vážou G- a F- aktin . Kalponiny jsou produktem 3 genů a dělí se na tzv. α-kalponin (h1 nebo bazický, 292 ak . , 34 kDa), β-kalponin (252 ak.) - který je produktem stejného genu jako α-kalponin , ale s výmazemaminokyseliny v segmentu 216-256. Dvě další izoformy, neutrální kalponin (h2 kalponin) a kyselý kalponin, jsou exprimovány v hladkých svalech a nesvalových buňkách. Dalšími zástupci kalponinů jsou SM22 a transgelin. Calponin má svůj název podle domény CH nebo Calponin Homology, přítomné mezi mnoha ABP ( aktin-vázající proteiny ). Navzdory této skutečnosti calponin nevykazuje vazbu aktinu přes toto místo (Gimona a Mital, 1998), ale místo toho váže lipidy .(Bogatcheva a Gusev, 1995; Fujii et al., 1995). Předpokládá se, že místo vázající aktin (Mezgueldi et al., 1992) je umístěno v oblasti mezi doménou CH a repeticemi podobnými kalponinu (CLIK - repetice podobná calponinu). Calponin je termostabilní. Molekulová hmotnost izoformy hladkého svalstva je 34 kDa. Jiné tkáně představují kyselejší izoformy kalponinu, které nevážou vápník , ale váží kalmodulin . Vazba Ca 2+ /kalmodulinu inhibuje vazbu na aktin. Fosforylace kalponinu serin-threonin kinázami vede k podobnému účinku . Kalponin má také vazebné místo pro tropomyosin .
Calponin je protein vázající aktin, kalmodulin a tropomyosin, který byl nalezen ve tkáních hladkého svalstva několika obratlovců a v některých nesvalových buňkách. Během přípravy tenkých vláken kuřecího žaludku se ukázalo, že obsahují aktin, tropomyosin, caldesmon a calponin v molárním poměru 7:0,9:0,6:0,7. Stejně jako caldesmon inhibuje kalponin aktivitu aktomyosinové ATPázy v roztoku, klouzavý aktin vzhledem k fosforylovanému myosinu in vitro , a tato inhibice je spouštěna Ca2 + /kalmodulinem. Inhibice je zrušena fosforylací proteinů in vitro . Tyto vlastnosti naznačují, že kalponin může být dalším regulátorem interakcí aktin-myosin.
Úplné nebo částečné chymotryptické štěpení calponinu se provádí při 25 °C s použitím hmotnostního poměru proteázy k substrátu 1:100 nebo 1:1000, v daném pořadí, v 10 mM imidazol - HCl , 30 mM NaCl , 2 mM MgCl2 , 4 mM NaN3 , pH 7,0, v nepřítomnosti nebo přítomnosti F-aktinu (4 mg/ml) (molární poměr aktin/kalponin = 3:1). Ve vhodných časových intervalech (0-60 min) se dobře definovaná množství proteinů smíchají se stejným objemem Laemmliho vroucího vzorkového pufru a připraví se pro gelovou elektroforézu . Pro síťovací reakce a vazebné experimenty je štěpení ukončeno 2,5 mM fenylmethylsulfonylfluoridem (PMSF) . Celková hydrolýza kovalentního komplexu calponin-aktin (11 mg/ml) s CNBr (67 mg/ml přidaný ve dvou stejných množstvích) se provádí po dobu 24 hodin v 70% kyselině mravenčí obsahující 14 mM p-merkaptoethanolu.
Calponin (0,7-1,3 mg/ml) v 10 mM imidazol-HCl, 30 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 4 mM NaN3, pH 7,0, ve směsi s nativním nebo subtilisinem štěpeným F-aktinem (2,4-4,5 mg/ml) ( molární poměr kalponin/aktin = 1:3) v přítomnosti 2 mM EDC a 5 mM NHS. Reakce byla prováděna při 25 °C po dobu 0-30 min a byla monitorována SDS gelovou elektroforézou. Caldesmon (1,4 mg/ml) se zesíťuje na F-aktin za stejných podmínek za použití molárního poměru proteinu 1:6. Kovalentní vazba mezi F-aktinem a 22 kDa NH2-terminálním chymotryptickým fragmentem kalponinu se získá následovně: 60 min chymotryptické digesce calponinu, při hmotnostním poměru enzymu k substrátu 1:1000, se doplní F-aktinem při molární poměr 1:3, po centrifugaci při 180 000 x g po dobu 1 hodiny při 4 °C se peleta resuspenduje v imidazol-HCl, pH 7,0, pufru. Pro preparativní separaci 76 kDa aduktu F-aktin-kalponin od nezesítěného kalponinu byl roztok zesítěného F-aktin-kalponinu (110 mg proteinu) získaný po 45 minutách reakce upraven v 3 mM β-merkaptoethanolu, dialyzován přes noc při 4 °C proti depolymerizačnímu pufru (50 mM Tris-HCl, 0,6 m KI, 5 mM thiosíran sodný, 0,5 mM ATP , 0,5 mM CaCl2 a 0,5 mM P-merkaptoethanol, pH 7,5) a poté se gel filtruje přes kolona Sephacryl -S-300 (1,6 x 120 cm), ekvilibrovaná při 4 °C ve stejném pufru. Počáteční proteinové frakce jsou eluovány obsahující 76 kDa adukt bez volného kalponinu, jak bylo analyzováno gelovou elektroforézou. Spojené frakce se dialyzují destilovanou vodou, lyofilizují se a podrobí digesci CNBr .