Imunofluorescenční analýza ( MFA - metoda fluorescenčních protilátek , imunofluorescence ) ( angl. Immunofluorescence ) - soubor imunologických metod pro kvalitativní a kvantitativní stanovení povrchových a intracelulárních antigenů ve vzorcích buněčných suspenzí (buněčné kultury, bakterie, mykoplazmata, rickettsie, viry ), krevní vzorky, kostní mozek, alveolární výplachy, tenké řezy tkání. Metoda umožňuje podrobně analyzovat biologické vzorky na přítomnost určitých antigenních determinant charakteristických pro určité patogeny nebo onemocnění, kvantifikovat povrchové i intracelulární proteiny a receptory. Vyšetření a vyhodnocení lze provádět ručně pomocí fluorescenčního mikroskopu nebo automatizovaně pomocí průtokového cytometru ( průtokový cytometr ) nebo mikročipového cytometru ( čipový cytometr ). Je možné použít konfokální mikroskop a robotický fluorescenční mikroskop (včetně těch kombinovaných s průtokovým cytometrem) v kombinaci se softwarovým systémem zpracování obrazu. V současnosti dostupné automatizované technologie umožňují analyzovat asi 50 různých antigenů v jednom vzorku pomocí sady různých fluorescenčních markerů ve formátu vysoce informativní mikroskopie a cytometrie (metody se nazývají high-content imaging , high-content cytometry , high-content screening ) a přibližně poloviční maximální sadu antigenů pomocí moderní průtokové cytometrie nebo konfokální mikroskopie. Hlavní praktické aplikace jsou onkologie, mikrobiologie, buněčná biologie, genetika, farmakologie atd.
Podstata metody spočívá ve vizualizaci antigenu specifickými protilátkami s fluorescenčními markery. Metodu konjugace globulinů s organickými fluorochromy vyvinul v roce 1942 A. Koons. [1] V současné době metoda využívá jak protilátky proti různým antigenům, tak specifická barviva pro DNA (např. DAPI ), RNA (např. Sybr Green II ), lipidy a proteiny.
V základní technice MFA se rozlišuje mezi přímou metodou vyvinutou A. Koonsem a Melvinem Kaplanem [2] a nepřímou metodou vyvinutou A. Koonsem a Wheelerem v původní verzi nepřímé MFA s doplňkem .
Při přímé metodě ( pMPA ) se na testovaný přípravek nebo buněčnou suspenzi aplikuje roztok protilátek přímo značených fluorescenčním barvivem. Tvorba komplexu antigen-protilátka je detekována fluorescenčním signálem ve formě záře různého stupně intenzity a jasnosti.
Nepřímou metodou ( nMFA ) jsou do preparátu aplikovány protilátky proti požadovaným antigenům (tzv. „první“ protilátky) a následně druhově specifické „druhé“ protilátky proti „prvním“ protilátkám, čímž se zabrání nespecifickým reakcím. V tomto případě je pouze druhá protilátka konjugována s fluorescenčním barvivem. Například, pokud se ve studii jako „první“ protilátky použijí myší protilátky, myší IgG, pak se jako „druhé“ použijí protidruhové anti-myší IgG konjugované s fluorescenčním barvivem. Komplex antigen-protilátka produkuje fluorescenční barvení pouze po navázání na "druhou" protilátku.
Nepřímé metody vyžadují pouze antiglobulinová séra s fluorochromy, ale vyžadují velký počet testovacích kontrol. Při nastavení přímou metodou se provádí pouze jedna kontrola, ačkoli v dřívějších verzích metody bylo vyžadováno mnoho monospecifických sér. Nevýhodou přímých typů MFA byla dlouhou dobu omezená citlivost kvůli přítomnosti možných zkřížených reakcí mezi objekty podobnými antigenním složením a nespecifická fluorescence díky adsorpci fluorescenčních globulinů na různé prvky léčiva. V současnosti používané komerčně standardní konjugáty obsahující imunoglobuliny ke studovaným antigenům. Použití bioinženýrských imunoglobulinů a vysoký stupeň čištění protilátek umožnily prakticky vynulovat nespecifické reakce, což umožnilo další technologický rozvoj metody.
Protože se přímá metoda v současné době vyhýbá nespecifickým reakcím, využívají automatizované metody převážně přímou metodu imunofluorescence.
Výsledky manuálního mikroskopického hodnocení jsou popsány v tzv. „křížcích“ (od jednoho + do čtyř ++++) – subjektivní gradace závažnosti reakce okem výzkumníka. V automatizovaných metodách se jako detektor používají fotonásobiče nebo vysoce citlivé fluorescenční kamery, které umožňují záznam signálu s vysokou přesností a udávají hodnotu relativní úrovně fluorescence (relativní poměr fluorescence) v širokém rozsahu stupnice. Absolutní hodnota se vypočítá pomocí kontrol nebo antigenů se známým konstantním obsahem ve vzorku. Při použití automatizovaných metod je zpracování dat prováděno specializovanými programy pro zpracování obrazu a analýzu cytometrických dat.
Metoda má rozhodující význam při včasné diagnostice a léčbě onkologických onemocnění (imunohistochemie, onkohematologie), diagnostice infekčních onemocnění (například stanovení CD4+ buněk u HIV) a dědičných syndromů. Intenzivně se rozvíjejí automatizované metody, včetně oblastí vysokoobsahového zobrazování a vysokoobsahové cytometrie , kombinované metody cytometrie-mikroskopie ( cytometr-mikroskop ), které se paralelně vyvíjejí již od 90. let , dále metody mikročipové cytometrie s plasmonovou holografií. [3 ] ve kterých jsou jednotlivé protilátky značeny nanočásticemi.
| Patologie v medicíně | |
|---|---|
| patohistologie | Poškození buněk apoptóza Nekrobióza karyopyknóza karyorexií karyolýza Nekróza koagulační nekróza kolikvační nekróza gangréna sekvestrace infarkt Buněčná adaptace Atrofie Hypertrofie Hyperplazie Dysplazie Metaplazie skvamózní glandulární Dystrofie Protein mastný uhlohydrát Minerální |
| Typické patologické procesy |
|
| Laboratorní diagnostika a pitva |
|