DNA stopa

DNA footprinting je metoda  hledání vazebných sekvencí DNA-vazebných proteinů ve struktuře DNA . Tato metoda se používá ke studiu interakce proteinů s DNA jak in vitro (s komplexy DNA-protein izolovanými z buněk), tak in vivo (za fyziologických podmínek uvnitř buňky).

Například transkripční faktory se vážou na promotory , zesilovače nebo tlumiče a regulují expresi jednotlivých genů v genomu . Metoda DNA footprintingu umožňuje stanovit sekvence DNA, na které se tyto regulační proteiny vážou. Metoda je vhodná i pro rychlé vyhledávání ( screening ) specifických proteinů, které se vážou na konkrétní sekvenci DNA.

Metoda získala svůj název z anglického slova „footprint“, označujícího stopu nebo stopu. [1] .

Historie

V roce 1978 vyvinuli David Galas a Albert Schmitz techniku ​​DNA footprintingu ke studiu vazebné specifity represorového proteinu na laktózový operon . Metoda footprintingu byla založena na sekvenační metodě Maxam-Gilbert. [2]

Metoda

Nejjednodušší aplikací této metody je určit, zda se protein váže na určitou oblast DNA. [3]

1. Pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) je požadovaná sekvence DNA amplifikována a značena, což je pravděpodobné vazebné místo pro protein. Ideální velikost amplikonu je v tomto případě mezi 50 a 200 bázemi .
2. Je přidán požadovaný protein, zatímco část DNA je ponechána nedotčená pro pozdější srovnání.
3. Přidává se řezné činidlo - chemické nebo enzymatické povahy. Řezací prostředek náhodně zavádí zlomy v DNA. Reakční podmínky jsou voleny tak, že každý řetězec DNA je řezán pouze na jednom místě. Protein, který se specificky váže na nukleotidovou sekvenci DNA, chrání vazebné místo před rozříznutím.
4. Produkty degradace DNA jsou separovány elektroforézou na polyakrylamidovém gelu . Fragmenty DNA, které nebyly navázány na protein, budou rozřezány na náhodných místech a budou distribuovány v gelu ve formě "žebříčku". Fragmenty DNA, na které se protein naváže, budou chráněny před rozříznutím a na takovém „žebříku“ vytvoří otisk, stopu ( anglicky  footprint ). Současně s footprintingem lze provést sekvenování DNA metodou Maxam-Gilbert a stanovit sekvenci nukleotidů, na které se váže odpovídající protein.

Označení

Analyzované molekuly DNA k určení umístění vazebného místa proteinu mohou být značeny odděleně od 3'- a od 5'-konce. Používají se značky:

• Radioaktivní značky se tradičně používají ke značení fragmentů DNA pro footprinting, tento způsob značení byl vyvinut na metodách sekvenování DNA podle Maxam-Gilberta . Tato varianta je velmi citlivá, malá množství DNA lze vizualizovat radioaktivní značkou.
• Fluorescenční štítky jsou náhradou za nebezpečné radioaktivní. Fluorescenční značení je však pro zobrazování DNA méně citlivé a nízké koncentrace stopových produktů nelze detekovat. K vizualizaci produktů značených fluorofory se používají sekvenační gely a techniky kapilární elektroforézy . [3]

Řezný prostředek

Jako řezné činidlo pro degradaci studované DNA se používá DNáza typu I [3] [4] , Fentonovo činidlo [5] , ultrafialové ozáření [6] .

Poznámky

1. ↑ Molekulární biologie buňky. M.: Mir, 1994.
2. ↑ Galas D a Schmitz A. (1978) DNAse footprinting: jednoduchá metoda pro detekci vazebné specificity protein-DNA. Výzkum nukleových kyselin. 5(9):3157-70.
3. ↑ 1 2 3 Hampshire A, Rusling D, Broughton-Head V a Fox K. (2007) Footprinting: Metoda pro stanovení sekvenční selektivity, afinity a kinetiky DNA-vazebných ligandů. metody. 42:128-140.
4. ↑ LeBlanc B a Moss T. (2001) DNase I Footprinting. Metody v molekulární biologii. 148:31-8.
5. ↑ Zaychikov E, Schickor P, Denissova L a Heumann H. (2001) Hydroxyl radikální stopa. Metody v molekulární biologii. 148:49-61.
6. ↑ Geiselmann J a Boccard F. (2001) Ultrafialová laserová stopa. Metody v molekulární biologii. 148:161-73.