Řada biochemických spínačů řídí přechody mezi různými fázemi buněčného cyklu a v jejich rámci . Buněčný cyklus je série komplexních, uspořádaných, po sobě jdoucích událostí, které řídí rozdělení jedné buňky na dvě buňky a zahrnuje několik odlišných fází. Mezi fáze patří fáze G1 a G2, replikace DNA neboli S fáze a vlastní proces buněčného dělení, mitózy nebo M fáze [1] . Během M fáze se chromozomy oddělují a dochází k cytokinezi.
Přepínače udržují uspořádaný vývoj buněčného cyklu a fungují jako kontrolní body, které zajistí, že každá fáze proběhne správně, než se přejde k další fázi [1] . Například Cdk nebo cyklin-dependentní kináza je hlavním regulátorem buněčného cyklu a umožňuje buňce přechod z G1 na S nebo z G2 na M přidáním fosfátu k proteinovým substrátům. Ukázalo se, že takové vícesložkové (zahrnující mnoho vzájemně propojených proteinů) přepínače generují rozhodující, spolehlivé (a potenciálně nevratné) přechody a spouštějí stabilní oscilace [2] . V důsledku toho jsou předmětem aktivního výzkumu, který se snaží pochopit, jak takové složité vlastnosti souvisí se systémy biologické kontroly [2] [3] [4] .
Mnoho biologických obvodů produkuje komplexní výstupy pomocí jedné nebo více zpětnovazebních smyček . V sekvenci biochemických dějů bude zpětná vazba odkazovat na downstream prvek sekvence (B na sousedním obrázku), který ovlivňuje nějakou protisměrnou složku (A na sousedním obrázku), aby v budoucnu ovlivnil svou vlastní produkci nebo aktivaci (výstup). Pokud tento prvek působí na zvýšení vlastního výkonu, pak se podílí na pozitivní zpětné vazbě (modrá šipka). Smyčka s kladnou zpětnou vazbou je také známá jako samoposilující smyčka a je možné, že tyto smyčky by mohly být součástí větší smyčky, protože to je běžné v regulačních obvodech [1] .
Naopak, pokud tento prvek vede k vlastní inhibici prostřednictvím vyšších prvků, jedná se o kanonicky negativní zpětnou vazbu (červená tupá šipka). Smyčka záporné zpětné vazby je také známá jako vyrovnávací smyčka a často lze pozorovat oscilace, ve kterých se zpožděný signál zpětné vazby používá k udržení homeostatické rovnováhy v systému [1] .
Zpětnovazební smyčky lze použít pro zesílení (pozitivní) nebo autokorekci (negativní). Správná kombinace pozitivních a negativních zpětných vazeb může vyvolat přecitlivělost a bistabilitu [5] [6] , což zase může generovat kritické přechody a oscilace.
Pozitivní a negativní zpětné vazby ne vždy fungují dobře. V mechanismu biochemických spínačů spolupracují na vytvoření flexibilního systému. Například podle Pfeuty & Kaneko (2009) k překonání nedostatku biochemických systémů mohou regulační smyčky pozitivní zpětné vazby interagovat s negativními regulačními smyčkami, aby se usnadnilo zotavení ze stabilních stavů [7] . Koexistence dvou stabilních stavů je známá jako bistabilita, která je často výsledkem pozitivní zpětné vazby.
Příkladem, který odhaluje interakci více negativních a pozitivních zpětnovazebních smyček, je aktivace cyklin-dependentních proteinkináz nebo Cdks14. Pozitivní zpětnovazební smyčky hrají roli při přepínání buněk z nízké na vysokou aktivitu Cdk. Interakce mezi dvěma typy smyček se projevuje mitózou. Zatímco pozitivní zpětná vazba zahajuje mitózu, negativní zpětná vazba podporuje inaktivaci cyklin-dependentních kináz komplexem stimulujícím anafázi. Tento příklad jasně ukazuje kombinované účinky pozitivní a negativní zpětné vazby na regulaci buněčného cyklu.
Reakce „všechno nebo nic“ na podnět se nazývá přecitlivělost . Jinými slovy, velmi malá změna stimulu způsobí velmi velkou změnu v reakci, čímž se vytvoří sigmoidální křivka dávka-odpověď. Přecitlivělou odezvu popisuje obecná rovnice V = S n /(S n + K m ), známá jako Hillova rovnice , kdy n, Hillův koeficient, je větší než 1. Sklon sigmoidní křivky závisí na hodnotě z n. Hodnota n = 1 dává hyperbolickou nebo Michaelovu odezvu. Ultracitlivosti je dosaženo v různých systémech; pozoruhodným příkladem je kooperativní vazba hemoglobinu enzymu na jeho substrát. Vzhledem k tomu, že hypersenzitivní reakce je téměř „digitální“, lze ji použít ke zvýšení reakce na podnět nebo k náhlému náhlému přechodu (mezi stavy „vypnuto“ a „zapnuto“).
Ultrasenzitivita hraje důležitou roli v regulaci buněčného cyklu. Například Cdk1 a Wee1 jsou regulátory mitózy a jsou schopny se navzájem inaktivovat prostřednictvím inhibiční fosforylace. Jedná se o dvojitou negativní zpětnovazební smyčku, ve které se oba regulátory vzájemně deaktivují. Podle Kim et al., (2007) musí existovat ultrasenzitivní prvek pro vytvoření bistabilní odezvy. Ukázalo se, že Wee1 má hypersenzitivní odezvu na Cdk1, což pravděpodobně vyplývá z kompetice substrátu mezi různými fosforylačními místy na Wee1 [8] .
Bistabilita implikuje hysterezi a hystereze implikuje multistabilitu. Multistabilita označuje přítomnost dvou nebo více stabilních stavů pro daný vstup. Bistabilita je tedy schopnost systému existovat ve dvou stacionárních stavech [9] . Jinými slovy, existuje řada hodnot stimulu, pro které může mít odpověď dvě hodnoty v ustáleném stavu. Bistabilita je doprovázena hysterezí , což znamená, že se systém přednostně přibližuje k jednomu ze dvou stabilních stavů v závislosti na své historii. Bistabilita vyžaduje zpětnou vazbu a také ultracitlivý obvodový prvek.
Za vhodných okolností mohou pozitivní a negativní zpětnovazební smyčky poskytnout podmínky pro bistabilitu; například díky pozitivní zpětné vazbě spojené s ultracitlivým prvkem odezvy obvodu. Hysteretický bistabilní systém může fungovat jako spolehlivý reverzibilní spínač, protože je pro systém obtížnější přecházet mezi stavy „zapnuto“ a „vypnuto“ (ve srovnání s ekvivalentní monostabilní hypersenzitivní odezvou). Systém lze také nakonfigurovat tak, že jeden z přechodů je fyzicky nedosažitelný; například žádné snížení stimulu nevrátí systém do stavu „vypnuto“, pokud je již ve stavu „zapnuto“. To vytvoří spolehlivý nevratný spínač. Jak navrhnout jednoduchý biologický přepínač je popsán v konferenčním příspěvku [10] .
Mezi síťovými topologiemi neexistuje žádná korespondence jedna ku jedné, protože mnoho sítí má podobné vstupní a výstupní vztahy. Topologie sítě neimplikuje vstup nebo výstup a podobně vstup nebo výstup neimplikuje topologii sítě. Právě z tohoto důvodu je parametrizace pro činnost obvodu velmi důležitá. Pokud je dynamika vstupu srovnatelná nebo rychlejší než odezva systému, může se odezva jevit jako hysterická.
Níže jsou popsány tři přepínače buněčného cyklu, které poskytují náhlé a/nebo nevratné přechody prostřednictvím použití některých z výše popsaných mechanismů.
Přechod G1/S , lépe známý jako kontrolní bod u pučících kvasinek (restrikční bod u jiných organismů), reguluje průběh buněčného cyklu [1] . V tomto kontrolním bodě se buňky buď zastaví před replikací DNA (kvůli omezení živin nebo feromonovému signálu), prodlouží G1 (kontrola velikosti) nebo zahájí replikaci a projdou zbytkem buněčného cyklu. Regulační síť nebo regulon G1/S v pučících kvasinkách zahrnuje cykliny G1 Cln1, Cln2 a Cln3, Cdc28 (Cdk1), transkripční faktory SBF a MBF a inhibitor transkripce Whi5 [2] . Cln3 interaguje s Cdkl a iniciuje sekvenci událostí fosforylací široké škály cílů včetně SBF, MBF a Whi5 . Fosforylace Whi5 způsobí, že se přesune z jádra a zabrání tomu, aby byl inhibován SBF a MBF. Aktivní SBF/MBF řídí přechod G1/S, včetně cyklinů typu B a iniciace replikace DNA, tvorby pupenů a duplikace vřeténka. Navíc SBF/MBF reguluje expresi Cln1 a Cln2, které mohou také interagovat s Cdk1, aby podpořily fosforylaci svých cílů.
Původně se předpokládalo, že tento přepínač G1/S funguje jako lineární sekvence událostí začínajících v Cln3 a končících ve fázi S [11] . Nicméně pozorování, že kterýkoli Clns byl dostatečný k aktivaci regulonu, naznačuje, že Cln1 a Cln2 mohou být schopny použít pozitivní zpětnou vazbu k aktivaci své vlastní transkripce. To by mělo za následek neustále se zrychlující cyklus, který by mohl fungovat jako nevratný bistabilní klopný obvod [2] . Scotheim et al., použili měření jednotlivých buněk v pučících kvasinkách, aby ukázali, že k této pozitivní zpětné vazbě skutečně dochází [2] . Malé množství Cln3 indukuje expresi Cln1/2 a poté vstupuje do hry zpětnovazební smyčka, která vede k rychlému a náhlému výstupu Whi5 z jádra a následně ke koherentní expresi genů regulonu G1/S. Při absenci koherentní genové exprese trvá buňkám déle, než opustí G1, a významná část se dokonce zastaví před S fází, což zdůrazňuje důležitost pozitivní zpětné vazby při posilování G1/S přepínače.
Kontrolní bod buněčného cyklu G1/S řídí přechod eukaryotických buněk z první fáze mezery G1 do fáze syntézy DNA, S. V tomto přepínači v savčích buňkách existují dvě kinázy buněčného cyklu, které pomáhají kontrolovat kontrolní bod: buněčný cyklický kinázy CDK4/6-cyklin D a CDK2-cyklin E [1] . Pro kontrolu tohoto kontrolního bodu je důležitý transkripční komplex obsahující Rb a E2F. V první fázi mezery se represorový komplex Rb-HDAC váže na transkripční faktory E2F-DP1, čímž inhibuje downstream transkripci. Fosforylace Rb pomocí CDK4/6 a CDK2 disociuje komplex Rb-represor a slouží jako přepínač buněčného cyklu. Po fosforylaci Rb je odstraněna inhibice transkripční aktivity E2F. To umožňuje transkripci genů S-fáze kódujících proteiny, které zvyšují G1 přechod na S-fázi.
Ke kontrole kontrolních bodů se používá mnoho různých stimulů, včetně TGFb, poškození DNA, kontaktní inhibice, replikativního stárnutí a stažení růstového faktoru. První čtyři působí indukcí členů INK4 nebo Kip/Cip rodiny inhibitorů kináz buněčného cyklu. TGFb inhibuje transkripci Cdc25A, fosfatázy, která aktivuje kinázy buněčného cyklu, a odstranění růstového faktoru aktivuje GSK3b, který fosforyluje cyklin D. To vede k jeho rychlé ubikvitinaci [12] .
G2 začíná E2F-zprostředkovanou transkripcí cyklinu A, který tvoří komplex cyklin A-Cdk2. K pokračování mitózy je komplex cyklin B - Cdk1 (nejprve objevený jako faktor přispívající k MPF nebo M-fázi; Cdk1 je také známý jako Cdc2 u štěpných kvasinek a Cdc28 u pučících kvasinek) aktivován Cdc25 , protein fosfatázou [1 ] . Když začne mitóza, jaderný obal se rozpadne, chromozomy se zkondenzují a stanou se viditelnými a buňka se připravuje na dělení. Aktivace cyklinu B -Cdk1 vede k destrukci jaderné membrány, která je typická pro iniciaci mitózy [1] .
Komplex cyklinu B-Cdk1 je zapojen do regulačního okruhu, ve kterém Cdk1 může fosforylovat a aktivovat svůj aktivátor Cdc25 (pozitivní zpětná vazba) a fosforylovat a inaktivovat svůj inaktivátor Wee1 kinázu (dvojitá negativní zpětná vazba) [1] . Tento obvod může fungovat jako bistabilní klopný obvod [13] s jedním ustáleným stavem v G2 (Cdk1 a Cdc25 vypnuto, Wee1 zapnuto) a druhým ustáleným stavem ve fázi M (Cdk1 a Cdc25 aktivní, Wee1 vypnuto). Samotný Wee1 je však regulován jinými faktory, jako je Cdr2 .
To bylo navrženo a obhajováno Jinem a kol. [14] ve své sérii experimentů s lidskou buněčnou linií HeLa v roce 1998 ukázali, že je to prostorové uspořádání cyklinu B uvnitř buňky, které iniciuje mitózu. Jak je známo z předchozích experimentů jak s lidskými buňkami, tak s oocyty hvězdice, Jin et al. shrnují, že cyklin B1 je hojný v cytoplazmě během nedělících se fází mitózy, ale je identifikován v jádře v komplexu s Cdk1 těsně předtím, než buňka vstoupí do mitózy. Jiní experimentátoři ukázali, že buňky se nebudou dělit, pokud cyklin B zůstane v cytoplazmě. K dalšímu zkoumání vlivu prostorové polohy cyklinu B na buněčné dělení a řízení cyklu, Jin et al. označený cyklin B jaderným lokalizačním signálem (NLS), který udržuje cyklin uvnitř jádra. Zpočátku tento cyklin B NLS nevytvářel očekávaný účinek zrychleného vstupu do mitózy. Tento výsledek je způsoben inhibicí znázorněnou na obrázku níže. Wee1, inhibitor komplexu cyklin B-Cdk1, je lokalizován v jádře a pravděpodobně fosforyluje cyklin B NLS, takže nemůže fungovat tak, jak bylo zamýšleno. Tento postulát byl potvrzen, když Jin et al. použili Cdc2AF, nefosforylovaný mutant Cdkl, a pozorovali zrychlený vstup do buněčného dělení v důsledku jaderné lokalizace cyklinu B. Proto je jaderná lokalizace cyklinu B nezbytná, ale nestačí ke spuštění buněčného dělení.
Ve studii regulace buněčného cyklu Jin et al. manipulovaných buněk k posouzení lokalizace cyklinu B v buňkách s poškozením DNA. Prostřednictvím kombinace poškození DNA a jaderné lokalizace exogenního cyklinu B byli schopni určit, že by se buňky dělily i s poškozením DNA, pokud by byl cyklin B nucen být exprimován v jádře. To naznačuje, že prostorová lokalizace cyklinu B může hrát roli kontrolního bodu mitózy. Pokud se buňky normálně nedělí, když je jejich genetická informace poškozena, ale vstoupí do mitózy, pokud je endogenní cyklin B exprimován v jádře, je pravděpodobné, že translokace cyklinu B do cytoplazmy je mechanismem, který brání vstupu nezralých mitotických buněk. Tuto hypotézu dále potvrdil Jin et al. Analýza buněk zadržených v G2 v důsledku poškození DNA. V těchto buňkách Jin et al. pozorovali vysoké hladiny aktivity komplexu cyklin B-Cdc2 v cytoplazmě. To potvrzuje dříve zmíněnou teorii, protože ukazuje, že Cdc2 může aktivovat cyklin bez okamžité translokace do jádra. Navíc akumulace komplexů cyklinu B-Cdk1 v cytoplazmě buněk, které se nedělí v důsledku poškození DNA, podporuje teorii, že je to jaderná lokalizace cyklinu B, která iniciuje mitotický vstup.
Prostorová lokalizace cyklinu B tedy hraje roli při vstupu do mitózy. Translokace cyklinu B z cytoplazmy do jádra je nezbytná pro buněčné dělení, ale není dostatečná, protože jeho inhibitory neumožňují buňce předčasně vstoupit do mitózy. Kromě zachování inhibice komplexu cyklin B-Cdk1 je předčasnému buněčnému dělení zabráněno translokací samotného cyklinu B. Komplex cyklin B-Cdk1 zůstane v cytoplazmě v buňkách s poškozením DNA, spíše než se přesune do jádra, čímž zabrání buňce inhibovat vstup buňky do mitózy. Další otázkou, kterou si výzkumníci v této oblasti kladou, je, jaký konkrétní mechanismus reguluje tuto translokaci.
Santos et al [15] navrhli, že translokace cyklinu B je regulována mechanismem pozitivní zpětné vazby, který je podobný tomu, který reguluje aktivaci komplexu cyklin B-Cdk1. Věřili, že pozitivní zpětnovazební smyčka zahrnuje fosforylaci cyklinu B a jeho translokaci do jádra. Aby to mohli začít zkoumat, nejprve potvrdili některé výsledky Jin et al. experimenty využívající imunofluorescenci k prokázání cyklinu B v cytoplazmě před dělením a translokaci do jádra k zahájení mitózy, kterou použili, ve srovnání s narušením jaderného obalu (NEB). S použitím jaderného cyklinu, který nemůže být inaktivován pomocí Wee1 nebo Myt1, Santos a kol., pozorovali, že aktivní jaderný cyklin rekrutuje více cyklinu z cytoplazmy, aby se přesunul do jádra. Toto pozorování potvrdili použitím léčby iRap rapamycinem. iRap indukuje translokaci značeného cyklinu B z cytoplazmy do jádra. Zejména Santos a kol. viděli, že neznačený cyklin B migruje s cyklinem B pod vlivem iRap. Neznačený cyklin nereaguje na léčbu a pohybuje se nezávisle na léčeném cyklinu. To potvrzuje první část smyčky pozitivní zpětné vazby, že jaderná lokalizace cyklinu B, která vede k mitotickému vstupu, podporuje zvýšenou translokaci cytoplazmatického cyklinu B do jádra, což dále usnadňuje migraci zbývajícího cytoplazmatického cyklinu B do jádra atd. .
Santos a kol., dále naznačují, že fosforylace cyklinu B je další složkou pozitivní zpětné vazby. Všimli si, že cyklin B přirozeně vstupuje do jádra před NEB. Naproti tomu mutovaný, nefosforylovaný cyklin B vstupuje do jádra během NEB. To je překvapivé, protože pro buněčný cyklus je charakteristické přesunout cyklin do jádra před NEB, aby buněčný cyklus postoupil do mitotického dělení. Santos a kol. dochází k závěru, že fosforylace cyklinu B podporuje translokaci do jádra. Kromě toho však translokace do jádra podporuje fosforylaci cyklinu. Autoři poznamenávají, že fosforylace cyklinu B v jádře je devatenáctkrát příznivější než v cytoplazmě díky menšímu celkovému objemu jádra, což poskytuje vyšší rychlost fosforylace. Zvýšená translokace v důsledku fosforylace a zvýšená fosforylace v důsledku translokace ilustrují smyčku pozitivní zpětné vazby, která se podobá dříve objevené, která aktivuje komplex cyklin B-Cdk1.
Závěrem lze říci, že pro vstup buňky do mitózy je nutná jaderná lokalizace cyklinu B. Translokace cyklinu z cytoplazmy do jádra, která zajišťuje buněčné dělení, je regulována smyčkou pozitivní zpětné vazby. Aktivní cyklin B se přesouvá do jádra a podporuje aktivaci a pohyb dalších cyklinových jednotek umístěných v jádře. Tento jev je zesílen při zvažování fosforylace. Fosforylace cyklinu B podporuje jadernou translokaci a cyklin B v jádře je mnohem pravděpodobněji fosforylován, takže jaderná lokalizace zase podporuje fosforylaci cyklinu B.
Jakmile jsou buňky v mitóze, cyklin B-Cdk1 aktivuje anafázi stimulující komplex (APC), který zase inaktivuje cyklin B-Cdk1 degradací cyklinu B, což případně vede k odchodu z mitózy. Kombinace funkce bistabilní odezvy Cdk1 s negativní zpětnou vazbou z APC může generovat tzv. relaxační oscilátor [3] s ostrými výbuchy aktivity Cdk1, které spouštějí stabilní mitotické cykly. V relaxačním oscilátoru se však řídicí parametr pohybuje pomalu s ohledem na dynamiku odezvy systému, což může být přesnou reprezentací mitotického vstupu, ale ne nutně mitotického výstupu.
K opuštění mitotického stadia buněčného cyklu je nutné inaktivovat komplex cyklin B-Cdk1. Buňky se pak mohou vrátit do první fáze mezery G1 a počkat, až cyklus bude znovu pokračovat.
V roce 2003 Pomerening et al. poskytl silný důkaz pro tuto hypotézu tím, že prokázal hysterezi a bistabilitu v aktivaci Cdk1 v cytoplazmatických extraktech oocytů Xenopus [3] . Nejprve prokázali přerušovanou špičkovou odpověď Cdk1 na změnu koncentrace nedegradovatelného cyklinu B (k oddělení sítě odezvy Cdk1 od negativní zpětné vazby zprostředkované APC). Taková odezva však bude odpovídat jak monostabilnímu supersenzitivnímu přechodu, tak i bistabilnímu přechodu. Aby rozlišili mezi těmito dvěma možnostmi, měřili hladiny aktivního Cdk1 v ustáleném stavu v reakci na měnící se hladiny cyklinu, ale ve dvou samostatných experimentech, jeden začal s mezifázovým extraktem a druhý začal s extraktem již v mitóze. Při středních koncentracích cyklinu našli dvě stacionární koncentrace aktivního Cdk1. Který ze dvou ustálených stavů byl obsazen, závisel na historii systému, tj. zda začaly mezifázovým nebo mitotickým extraktem, účinně vykazujícím hysterezi a bistabilitu.
Ve stejném roce Sha et al [16] nezávisle dospěli ke stejnému závěru tím, že našli hysterezní smyčku také pomocí extraktů z vajec Xenopus laevis. V tomto článku byly testovány tři předpovědi Nowak-Tysonova modelu, aby se dospělo k závěru, že hystereze je hnací silou "přechodů buněčného cyklu do az mitózy". Předpovědi Nowak-Tysonova modelu jsou společné pro všechny bifurkace sedlových bodů. Bifurkace sedlových bodů jsou extrémně užitečné v nedokonalém světě, protože pomáhají popsat nedokonalé biologické systémy. První předpověď byla, že prahová koncentrace cyklinu pro vstup do mitózy je vyšší než prahová koncentrace cyklinu pro výstup z mitózy, a to bylo potvrzeno doplněním cyklických vaječných extraktů nedegradovatelným cyklinem B a měřením prahu aktivace a inaktivace po přídavek cykloheximidu (CHX), který je inhibitorem syntézy proteinů [1] . Navíc byla potvrzena i druhá předpověď Nowak-Tysonova modelu: nereplikovaná deoxyribonukleová kyselina neboli DNA zvyšuje prahovou koncentraci cyklinu potřebnou pro vstup do mitózy. K dosažení tohoto závěru byly k extraktům uvolněným cytostatickým faktorem přidány CHX, APH (inhibitor DNA polymerázy) nebo obojí a nedegradovatelný cyklin B. Třetí a poslední předpověď, která byla testována a potvrzena v tomto článku, byla, že rychlost aktivace Cdc2 se zpomaluje blízko prahové koncentrace aktivace cyklinu. Tyto předpovědi a experimenty demonstrují chování přepínání podobné přepínání, které lze popsat hysterezí v dynamickém systému [17] .
Během přechodu z metafáze do anafáze je nesmírně důležité, aby se sesterské chromatidy správně a současně oddělily do opačných konců buňky [1] . Separace sesterských chromatid je zpočátku silně inhibována, aby se zabránilo předčasné separaci v pozdní mitóze, ale tato inhibice je zeslabena destrukcí inhibičních prvků komplexem stimulujícím anafázi (APC), jakmile je dosaženo biorientace sesterských chromatid. Jedním takovým inhibičním prvkem je securin , který zabraňuje destrukci kohesinu , komplexu, který drží sesterské chromatidy pohromadě, tím, že se naváže na proteázovou separázu , která se zaměřuje na Scc1 , podjednotku kohesinového komplexu, pro destrukci. V tomto systému může Cdc14 fosfatáza odstranit inhibiční fosfát ze sekurinu, čímž usnadní rozklad APC sekurinu uvolněním separázy. Jak ukázali Uhlmann et al., během připojení chromozomů k mitotickému vřeténku zůstávají chromatidy v párech, protože vazba mezi sestrami brání separaci [8] [18] . Koheze je ustavena během replikace DNA a závisí na kohesinu, což je multipodjednotkový komplex sestávající z Scc1, Scc3, Smc2 a Smc3. V kvasinkách se během přechodu z metafáze do anafáze Scc1 disociuje z chromozomů a sesterské chromatidy se oddělují. Toto působení je řízeno proteinem Esp1, který je pevně vázán na inhibitor anafáze Pds1, který je degradován komplexem stimulujícím anafázi. Aby se ověřilo, že Esp1 skutečně hraje roli v regulaci asociace chromozomů Scc1, byly buněčné kmeny zastaveny v G1 faktorem alfa. Tyto buňky zůstaly během vývoje ve stavu zastavení. Byly použity mutantní buňky Espl-1 a experiment byl opakován, přičemž Sccl se úspěšně vázal na chromozomy a zůstal asociován i po ukončení syntézy. To bylo důležité při demonstraci toho, že s Esp1 je omezena schopnost Scc1 stát se stabilně spojenou s chromozomy během G1 a Esp1 může skutečně odstranit Scc1 z chromozomů přímo.
To bylo prokázáno Holtem a kol. [4] , že separáza aktivuje Cdc14, který zase působí na sekurin, čímž vytváří smyčku pozitivní zpětné vazby, která zvyšuje jasnost přechodu z metafáze do anafáze a koordinaci separace sesterských chromatid [19] . Holt et al., zkoumali základ pozitivní zpětné vazby na fosforylaci sekurinu pomocí mutantních kmenů securinových kvasinek a testovali, jak změny v regulaci fosforu sekurinu ovlivňují synchronii separace sesterských chromatid. Jejich výsledky naznačují, že interference s touto pozitivní smyčkou securin-separase-cdc14 snižuje synchronii separace sesterských chromatid. Tato pozitivní zpětná vazba by mohla hypoteticky generovat bistabilitu při přechodu do anafáze, což by přimělo buňku učinit nevratné rozhodnutí oddělit sesterské chromatidy.
Výstup z mitózy je důležitým přechodovým bodem, který značí konec mitózy a začátek nové G1 fáze pro buňku, a buňka se musí spoléhat na specifické kontrolní mechanismy, aby se po ukončení mitózy nikdy nevrátila do mitózy, dokud nebude kompletní. Prošel etapami G1, S a G2 a prošel všemi požadovanými kontrolními body. Mnoho faktorů, včetně cyklinů , cyklin-dependentních kináz (CDK), ubikvitinových ligáz , inhibitorů cyklin-dependentních kináz a reverzibilní fosforylace , reguluje mitotický výstup, aby bylo zajištěno, že události buněčného cyklu probíhají ve správném pořadí s co nejmenším počtem chyb [20] . Konec mitózy je charakterizován rozpadem vřeténka, zkrácením kinetochorových mikrotubulů a výrazným vyrůstáním astrálních (nonkinetochorových) mikrotubulů [21] . Pro normální eukaryotickou buňku je výstup z mitózy nevratný [22] .
Bylo učiněno mnoho návrhů týkajících se kontrolních mechanismů používaných buňkou k zajištění nevratnosti výstupu z mitózy u modelového eukaryotického organismu, pučící kvasinky Saccharomyces cerevisiae . Proteolytická degradace regulátorů buněčného cyklu a odpovídající účinek na hladiny cyklin-dependentních kináz byl navržen jako mechanismus, který podporuje eukaryotický buněčný cyklus a zejména přechod z metafáze do anafáze. V této teorii komplex stimulující anafázi (APC), třída ubikvitin ligázy, podporuje degradaci mitotických cyklinů (Clb2) a anafázových inhibičních faktorů (PDS1, CUT2) k podpoře odchodu mitózy [23] . APC ubikvitinuje devítiaminokyselinový motiv známý jako disrupční box (D-box) v NH2-terminální doméně mitotických cyklinů pro degradaci proteazomu [23] . APC ve spojení s Cdc20 (APC-Cdc20) ubikvitinuje a cílí na mitotické cykliny (Clb2) pro degradaci v počáteční fázi. Současně APC-Cdc20 zprostředkovává degradaci sekurinů, které inhibují separázy vazbou v rané fázi anafáze. Uvolněná a aktivní separáza štěpí kohesin, který drží sesterské chromatidy pohromadě, což usnadňuje separaci sesterských chromatid a iniciuje mitotický výstup, čímž podporuje uvolňování Cdc14 z jadérka [24] [25] . V pozdější fázi downregulace Cdk1 a aktivace Cdc14, fosfatázy aktivující Cdh1, podporuje tvorbu APC ve spojení s Cdh1 (APC-Cdh1) k degradaci Clb2 [22] . Cdc20 a Cdh1, což jsou aktivátory APC, získávají substráty, jako je sekurin a cykliny typu B (Clb) pro ubikvitinaci [26] . Bez komplexů Cdk1-Clb2 k fosforylaci proteinů, které se podílejí na dynamice vřeténka, jako je Sli15, Ase1 a Ask1 , je zajištěno prodloužení vřeténka a segregace chromozomů, což usnadňuje odchod z mitózy [22] . Význam proteolytické degradace v eukaryotickém buněčném cyklu změnil pohled na buněčné dělení jako jednoduchou kinázovou kaskádu na složitější proces, který vyžaduje interakce mezi fosforylací, ubikvitinací a proteolýzou [23] . Experimenty využívající pučící kvasinkové buňky s cdc28-as1, alelou Cdk citlivou na INM-PP1 (ATP analog), však prokázaly, že destrukce cyklinů typu B (Clb) není nutná ke spuštění ireverzibilního odchodu z mitózy [22] . Degradace Clb2 zkracuje dobu inhibice Cdk1 potřebnou ke spuštění ireverzibilního mitotického odchodu, což naznačuje, že cyklinová proteolýza přispívá k dynamické povaze eukaryotického buněčného cyklu díky své pomalejší době působení, ale je nepravděpodobné, že by byla hlavním určujícím faktorem při spuštění ireverzibilního buněčný cyklus.. přechody [22] .
Byly učiněny objevy ukazující na důležitost hladiny inhibitorů cyklin-dependentních kináz v regulaci eukaryotického buněčného cyklu. Konkrétně se ukázalo, že hladina Sic1 , stechiometrického inhibitoru komplexů Clb-CDK v pučících kvasinkách, je zvláště důležitá pro ireverzibilní přechod G1-S v důsledku ireverzibilní aktivace kináz S-fáze [27] . Ukázalo se, že hladina Sic1 hraje důležitou roli při spouštění nevratného odchodu z mitózy (přechod M-G1) a také při přechodu G1-S. Během mitózy vede pokles hladin Cdk1 k aktivaci Cdc14, fosfatázy, která působí proti Cdk1 prostřednictvím aktivace Cdh1 a Swi5, transkripčního aktivátoru proteinů Sic1 [28] . Zatímco degradace Sic1 na určitou nízkou úroveň spustila S-fázi, akumulace Sic1 na určitou vysokou úroveň byla nutná ke spuštění nevratného odchodu z mitózy [22] . Inhibitory Cdk1 mohou vyvolat mitotický výstup, i když je degradace cyklinů typu B blokována expresí nedegradovatelných Clbs nebo inhibitorů proteazomu. Sesterské chromatidy však segregují a buňky se po vyplavení inhibitorů vrátí do mitózy, což ukazuje, že musí být dosaženo prahové hladiny inhibitorů, aby došlo ke spuštění ireverzibilního mitotického odchodu nezávislého na degradaci cyklinu [29] . Navzdory různým prahovým hodnotám hladiny Sic1, které jsou nutné ke spuštění mitotického odchodu ve srovnání s přechodem G1-S, se ukázalo, že hladina Sic1 hraje klíčovou roli v regulaci eukaryotického buněčného cyklu inhibicí aktivity CDK.
Protože eukaryotický buněčný cyklus zahrnuje mnoho proteinů a regulačních interakcí, lze ke zjednodušení komplexního biologického řetězce do společné struktury pro lepší analýzu použít dynamický systémový přístup [30] . Mezi čtyřmi možnými vstupně/výstupními vztahy se zdá, že vztah mezi úrovní Sic1 a mitotickým výstupem vykazuje charakteristiky nevratného bistabilního spínače řízeného zpětnou vazbou mezi APC-Cdh1, Sic1 a Clb2-Cdk1 [22] . Je známo, že bistabilita řídí biologické funkce, jako je řízení buněčného cyklu a buněčná diferenciace, a hraje klíčovou roli v mnoha buněčných regulačních sítích [31] . Bistabilní vstupně/výstupní spojení je charakterizováno dvěma stabilními stavy se dvěma bifurkačními body. Pro jeden konkrétní vstup je možný více východů v oblasti bistability označené dvěma body rozvětvení. Navíc bistabilní vazba vykazuje hysterezi: konečný stav/výstup závisí na historii vstupu a také na aktuální hodnotě vstupu, protože systém má paměť [32] . Jeden bifurkační bod má zápornou hodnotu řídicího parametru (bod bifurkace je na druhé straně osy), což vede k mezeře mezi dvěma stabilními stavy a nevratnosti přechodu z jednoho stavu do druhého. Pokud jde o výstup z mitózy, dva stabilní stavy jsou určeny mitózou a G1 fází. Jakmile hladina Sic1 (vstup) překročí práh, dojde k nevratnému přechodu z mitózy (stabilní stav I) do fáze G1 (stabilní stav II). V nedokonalém prostředí je jedinou bifurkací, která zůstává nezměněna, bifurkace sedlového uzlu . Bifurkace sedlového uzlu není narušena (očekávané obecné chování je očekávaným obecným chováním sedlového uzlu), zatímco transkritické a vidlicové bifurkace nejsou narušeny v případě nedokonalostí [33] . Jedinou jednorozměrnou bifurkací, která může existovat v nedokonalém biologickém světě, je tedy bifurkace sedlového uzlu [32] . Bistabilní spojení mezi přechodem M-G1 a úrovní Sic1 lze znázornit jako diagram dvou sedlových-uzlových bifurkací, ve kterých se chování systému kvalitativně mění s malou změnou řídicího parametru, hodnoty Sic1.
Protože chování buněčného cyklu je kriticky závislé na množství Sic1 v přechodném stavu M-G1, množství Sic1 je přísně regulováno zpětnou vazbou na systémové úrovni. Protože Cdk1-Clb2 inhibuje Sic1 fosforylací Sic1 a zpřístupňuje Sic1 pro degradaci prostřednictvím ubikvitinace, degradace Cdk1-Clb2 závislá na APC-Cdh1 nejen snižuje hladinu dostupných komplexů Cdk1-Clb2, ale také zvyšuje hladinu Sic1, což v turn dále více inhibuje funkci Cdk1-Clb2 [28] . Tato aktivace dvojité negativní zpětné vazby je zahájena degradací Cdk1-Clb2 závislou na APC-Cdc20 a uvolněním Cdc14 z nukleolárního proteinu Net1/Cfi1 [34] . Dráha FEAR (anaphase early release of Cdc14) usnadňuje Clb2-Cdk1-dependentní Net1 fosforylaci, která přechodně uvolňuje Cdc14 z Net1 [35] . Uvolněné komplexy Cdc14 a Clb2-Cdk1 přecházejí do vřeténka, které aktivuje mitózní výstupní síť (MEN). MEN zajišťuje trvalé uvolňování Cdc14 z jadérka [35] a Cdc14 působí proti aktivitě Clb2-Cdk1 aktivací Cdh1 a stabilizací Sic1 prostřednictvím aktivace transkripčního aktivátoru Sic1 Swi5 [36] . Sic1 se pozitivně reguluje inhibicí Cdk1-Clb2, aby uvolnil inhibici Swi5, a Cdh1 se také pozitivně reguluje inhibicí Clb2-Cdk1, aby uvolnil inhibici MEN, která může aktivovat Cdc14 a poté samotný Cdh1. Dvojitá negativní zpětná vazba tvořená APC-Cdh1 a Sic1 je nezbytná pro udržení nízké aktivity Clb2-Cdk1, protože Clb2 automaticky aktivuje svou syntézu aktivací transkripčních faktorů, komplexu Fkh2-Mcm1 Ndd1 [ 28] .
Cyklus eukaryotických buněk se skládá z různých kontrolních bodů a zpětnovazebních smyček, které zajišťují správné a úspěšné dělení buněk. Například během mitózy, kdy jsou duplikované chromozomy nesprávně připojeny k mitotickému vřeténku, proteiny kontrolního bodu sestavení vřetena (SAC), včetně Mad a Bub, inhibují APC-Cdc20, čímž oddalují vstup do anafáze a degradaci cyklinu typu B. Navíc, když jsou mitotická vřeténka vytěsněna, MEN a následně Cdc14 jsou inhibovány Bub2 a Bfa1-závisle, aby se zabránilo degradaci mitotických cyklinů a vstupu do anafáze [36] . Sic1 je dobrým příkladem toho, jak se zpětnovazební smyčky na úrovni systému vzájemně ovlivňují, aby snímaly podmínky prostředí a spouštěly přechody buněčného cyklu. Ačkoli je skutečný přechod M-G1 extrémně složitý a zahrnuje mnoho proteinů a regulací, přístup dynamických systémů nám umožňuje zjednodušit tento komplexní systém na bistabilní vztah vstup/výstup se dvěma bifurkacemi sedlových uzlů, ve kterých výstup (mitotický výstup) závisí na kritická koncentrace. Sic1. Pomocí jednorozměrné analýzy by bylo možné vysvětlit mnoho nevratných přechodových bodů v eukaryotickém buněčném cyklu, které jsou regulovány řízením a zpětnou vazbou na systémové úrovni. Mezi další příklady nevratných přechodových bodů patří Start (nevratný závazek k novému cyklu buněčného dělení), který lze vysvětlit nevratným bistabilním přepínačem, jehož řídicí parametr je přísně regulován systémovými zpětnými vazbami, včetně Cln2, Whi5 a SBF [ 37] .
| buněčného cyklu | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Fáze |
| ||||||||||
| Regulátoři |
| ||||||||||