Kontrolní body buněčného cyklu jsou kontrolní mechanismy v eukaryotickém buněčném cyklu , které zajišťují jeho správný vývoj. Každý kontrolní bod slouží jako potenciální bod ukončení buněčného cyklu , během kterého jsou hodnoceny buněčné podmínky, přičemž progrese různými fázemi buněčného cyklu nastává pouze tehdy, když jsou splněny příznivé podmínky. V buněčném cyklu je mnoho kontrolních bodů [1] , ale tři hlavní jsou: kontrolní bod G1, známý také jako počáteční nebo limitní kontrolní bod nebo hlavní kontrolní bod; kontrolní bod G2/M ; a přechod z metafáze do anafáze, známý také jako kontrolní bod vřetena [2] . Průchod těmito kontrolními body je z velké části určen aktivací cyklin-dependentních kináz regulačními proteinovými podjednotkami zvanými cykliny , jejichž různé formy jsou produkovány v každé fázi buněčného cyklu, aby řídily specifické události, které se v něm vyskytují [3] [4] .
Všechny živé organismy jsou produkty opakovaných cyklů buněčného růstu a dělení [5] . Během tohoto procesu, známého jako buněčný cyklus , buňka duplikuje svůj obsah a poté se rozdělí na dvě části. Cílem buněčného cyklu je přesně duplikovat DNA každého organismu a pak rozdělit buňku a její obsah rovnoměrně mezi dvě výsledné buňky. U eukaryot se buněčný cyklus skládá ze čtyř hlavních fází: G 1 , během kterého je buňka metabolicky aktivní a nepřetržitě roste; S fáze , během které dochází k replikaci DNA; G2 , během kterého pokračuje buněčný růst a buňka syntetizuje různé proteiny v rámci přípravy na dělení; a M fáze ( mitóza ), během níž se duplikované chromozomy (známé jako sesterské chromatidy ) rozdělí na dvě dceřiná jádra a buňka se rozdělí na dvě dceřiné buňky, z nichž každá má kompletní kopii DNA [6] . Ve srovnání s eukaryotickým buněčným cyklem je prokaryotický buněčný cyklus (známý jako binární štěpení ) relativně jednoduchý a rychlý: chromozom se replikuje od počátku replikace, sestavuje se nová membrána a buněčná stěna tvoří přepážku, která rozděluje buňku dva [7] .
Protože eukaryotický buněčný cyklus je složitý proces, eukaryota vyvinula síť regulačních proteinů známých jako systém kontroly buněčného cyklu , který sleduje a určuje postup buňky buněčným cyklem [5] . Tento systém funguje jako časovač nebo hodiny, které nastavují pevnou dobu, kterou musí buňka strávit v každé fázi buněčného cyklu, a zároveň také reaguje na informace přijaté z procesů, které řídí. Kontrolní body buněčného cyklu hrají důležitou roli v kontrolním systému tím, že detekují defekty, ke kterým dochází během základních procesů, jako je replikace DNA nebo segregace chromozomů , a způsobují zastavení buněčného cyklu v reakci, dokud nejsou defekty opraveny [8] . Hlavním mechanismem působení kontrolních bodů buněčného cyklu je regulace aktivity rodiny proteinkináz známých jako cyklin-dependentní kinázy (CDK), které se vážou na různé třídy regulačních proteinů známých jako cykliny, přičemž se tvoří specifické komplexy cyklin-CDK. aktivuje se v různých fázích buněčného cyklu. Tyto komplexy zase aktivují různé downstream cíle ke stimulaci nebo prevenci progrese buněčného cyklu [9] .
Kontrolní bod G1, známý také jako restrikční bod v savčích buňkách a výchozí bod v kvasinkách, je bod, ve kterém se buňka účastní buněčného cyklu. Když buňka projde G1, v závislosti na vnitřních a vnějších podmínkách může buď zpozdit G1, vstoupit do klidového stavu známého jako G0 , nebo překročit limitní bod [5] . Poškození DNA je hlavním znakem toho, že buňka je „omezená“ a nevstupuje do buněčného cyklu. Rozhodnutí zahájit nové kolo buněčného dělení nastává, když buňka aktivuje cyklin-CDK-dependentní transkripci, která podporuje vstup do S-fáze. Tento kontrolní bod poskytuje další proces [10] .
Během časné G1 existují tři transkripční represory známé jako kapsové proteiny, které se vážou na transkripční faktory E2F . Rodina genů E2F je skupina transkripčních faktorů, které se zaměřují na mnoho genů důležitých pro řízení buněčného cyklu, včetně cyklinů , CDK, regulátorů kontrolních bodů a proteinů opravy DNA. Nesprávná regulace rodiny E2F se často vyskytuje u případů rakoviny, což naznačuje, že rodina E2F je nezbytná pro přísnou regulaci replikace a dělení DNA [10] . Tři kapsové proteiny jsou retinoblastom (Rb), p107 a p130, které se vážou na transkripční faktory E2F, aby zabránily progresi za kontrolní bod G1.
Rodina genů E2F obsahuje některé proteiny s aktivačními mechanismy a některé proteiny s represivními mechanismy. P107 a p130 působí jako korepresory pro E2F4 a E2F5, které potlačují transkripci G1-to-S stimulačních faktorů. Třetí kapsový protein, Rb, se váže a potlačuje E2F1, E2F2 a E2F3, což jsou proteiny E2F s aktivační schopností [10] .
Pozitivní zpětná vazba hraje zásadní roli v regulaci přechodu z G1 fáze do S fáze, zejména s ohledem na fosforylaci Rb komplexem Cyklin/CDK protein. Rb bez fosfátu nebo nefosforylovaný Rb reguluje výstup a diferenciaci G0 buněčného cyklu. Na začátku G1 fáze signalizují růstové faktory a poškození DNA zvýšení hladiny cyklinu D, který se následně váže na Cdk4 a Cdk6 za vzniku komplexu CyclinD:Cdk4/6 [11] . O tomto komplexu je známo, že inaktivuje Rb fosforylací. Podrobnosti fosforylace Rb jsou však poměrně složité a specifické ve srovnání s předchozími znalostmi o kontrolním bodu G1. CyclinD:Cdk4/6 umístí pouze jeden fosfát nebo monofosforylát Rb na jedno ze čtrnácti dostupných a jedinečných fosforylačních míst. Každá ze čtrnácti specifických monofosforylovaných izoforem se váže na členy rodiny E2F odlišně, což pravděpodobně zvyšuje rozmanitost buněčných procesů u savců [11] .
E2F4 a E2F5 závisí na p107 a p130, aby si zachovaly svou jadernou lokalizaci. Cyklin D:Cdk 4/6 však také fosforyluje p107 a p130, což je proces, který uvolňuje jejich vazbu na E2F 4 a 5 (které pak unikají do cytoplazmy) a umožňuje E2F 1-3 vázat se na DNA a zahájit transkripci. cyklin E [10] . Rb proteiny si zachovávají svůj monofosforylovaný stav během časné G1 fáze, zatímco cyklin E se akumuluje a váže se na Cdk2.
CyklinE:Cdk2 hraje další důležitou fosforylační roli v G1-to-S přechodu. Zejména CyclinE:Cdk2 podporuje pozitivní zpětnou vazbu, která vytváří přepínač vše nebo nic. V mnoha sítích genetické kontroly zajišťuje pozitivní zpětná vazba, že buňky mezi fázemi buněčného cyklu neproklouznou [12] . Cyklin E:Cdk2 pokračuje k fosforylaci Rb na všech svých fosforylačních místech, také označované jako "hyperfosforylace", což zajišťuje úplnou inaktivaci Rb. Hyperfosforylace Rb je považována za pozdní G1 restrikční bod, po kterém se buňka nemůže vrátit zpět do buněčného cyklu. V tomto okamžiku se proteiny E2F 1-3 vážou na DNA a transkribují cyklin A a Cdc 6 [11] .
Inhibitor cyklin-dependentní kinázy 1B (CDKN1B), také známý jako p27, se váže na CyclinE:Cdk2 a inhibicí brání aktivaci. Jak se však cyklin A hromadí a váže na Cdk2, tvoří komplex a inhibují p27. G1 fáze cyklin-dependentní kináza pracuje ve spojení s S-fází cyklin-dependentní kináza, aby zacílila na p27 pro degradaci. To zase poskytuje plnou aktivaci cyklinu A:Cdk2, komplexu, který fosforyluje E2F 1-3 a iniciuje jejich disociaci z oblastí promotorové DNA. To umožňuje E2F 6-8 vázat se na DNA a inhibovat transkripci [10] . Smyčka negativní zpětné vazby používaná k úspěšné inhibici inhibitoru p27 je dalším důležitým procesem používaným buňkami k zajištění jednosměrného pohybu a nevracení v buněčném cyklu.
Když dojde k poškození DNA nebo když buňka vykazuje jakékoli defekty, které způsobí, že zpomalí nebo zastaví buněčný cyklus v G1, dojde k zastavení prostřednictvím několika mechanismů. Rychlá reakce zahrnuje fosforylační události, které jsou spouštěny buď ATM ( mutovaná ataxia telangiektázie ) nebo ATR (mutovaná ataxia telangiektázie a Rad3 ) kinázou, které působí jako senzory v závislosti na typu poranění. Tyto kinázy fosforylují a aktivují efektorové kinázy Chk2 a Chkl, v daném pořadí, které dále fosforylují Cdc25A fosfatázu, čímž ji označují pro ubikvitinaci a degradaci. Protože Cdc25A aktivuje dříve zmíněný komplex cyklinu E-CDK2 odstraněním inhibičních fosfátů z CDK2, v nepřítomnosti Cdc25A zůstává cyklin E-CDK2 neaktivní a buňka zůstává v G1.
Pro udržení zástavy je iniciována další reakce, kterou Chk2 nebo Chkl fosforylují p53, supresor nádoru, a to stabilizuje p53 tím, že mu brání ve vazbě na Mdm2, ubikvitin ligázu, která inhibuje p53, což vede k jeho degradaci. Stabilní p53 pak působí jako transkripční aktivátor několika cílových genů, včetně p21, inhibitoru G1-to-S stimulujícího komplexu, cyklinu E-CDK2. Kromě toho je dalším mechanismem pro aktivaci p21 akumulace p16 v reakci na poškození DNA. p16 degraduje komplexy cyklinu D-CDK4, čímž způsobuje uvolnění p21 z komplexů, což vede k defosforylaci a aktivaci Rb, což umožňuje Rb vázat a inhibovat E2F 1-3, čímž brání buňce vstoupit do S fáze [ 13] . V poslední době byly některé aspekty tohoto modelu zpochybněny [14] .
Po replikaci DNA v S fázi buňka prochází fází růstu známou jako G2. Během této doby jsou produkovány nezbytné mitotické proteiny a buňka je opět podrobena regulačním mechanismům, aby byl zajištěn správný stav pro vstup do proliferativní mitotické (M) fáze. Tento přechod z G2 na M zahrnuje více mechanistických kontrolních bodů se společným sjednocujícím faktorem aktivity cyklin-Cdk.
Ačkoli mezi organismy existují rozdíly v požadovaných komplexech cyklin-Cdk, potřeba kinázové aktivity přetrvává a je obvykle zaměřena na jediné páření. U štěpných kvasinek existují tři různé formy mitotického cyklinu a u pučících kvasinek je jich šest, ale hlavním používaným cyklinem je cyklin B [15] . Cyklin B bude sloužit jako reference pro diskusi o přechodu kontrolního bodu G2/M.
Podobně jako ve fázi S zažívá G2 kontrolní bod poškození DNA. Buňka je znovu vyšetřena na poškození DNA nebo neúplnou replikaci a ATR a ATM kinázy jsou rekrutovány k poškození. Dochází také k aktivaci Chkl a Chk2, stejně jako k aktivaci p53, aby došlo k zastavení buněčného cyklu a zastavení přechodu do mitózy. Další složka S-fáze, prereplikační komplex, musí být inaktivována fosforylací cyklinu B-Cdk1 [16] .
Jak jsou hodnoceny tyto předchozí kontrolní body, akumulace proteinu G2 slouží k aktivaci aktivity cyklinu B-Cdk1 prostřednictvím mnoha mechanismů. cyklin A-Cdk2 aktivuje Cdc25, aktivátor cyklinu B-Cdk1, který pak deaktivuje inhibitor cyklinu B-Cdk1, Wee1. To má za následek pozitivní zpětnovazební smyčku významně zvyšující expresi cyklinu B a aktivaci Cdkl. Když buňka projde G2 a dosáhne spojení G2/M, kináza Plk1 fosforyluje Wee1, který cílí na degradaci Wee1 prostřednictvím komplexu ubikvitin ligázy SCF [17] . Další funkcí Plk1 je aktivace Cdc25 prostřednictvím fosforylace. Kombinovaný účinek degradace Wee1 a aktivace Cdc25 je čisté odstranění inhibiční fosforylace cdc2, která aktivuje cdc2. Plk1 je aktivován během přechodu G2/M pomocí Aurora A a Bora, které se hromadí během G2 a tvoří aktivační komplex. Komplex Plk1-Cdc2-cdc25 pak iniciuje smyčku pozitivní zpětné vazby, která slouží k další aktivaci Cdc2, a v kombinaci se zvýšením hladiny cyklinu B během G2 pak výsledné komplexy cdc2-cyklin B aktivují downstream cíle, které podporují vstup do mitózy [ 18] . Výsledná aktivita Cdk1 také aktivuje expresi Mem1-Fkh, přechodového genu G2/M [19] . Rychlý výbuch aktivity cyklinu B-Cdk1 je nezbytný, protože zahájení M-fáze je událost typu vše nebo nic spojená s hysterezí. Hystereze aktivity Cdk1 prostřednictvím cyklinu B vede ke vstupu do M fáze, čímž se nastavuje minimální práh pro koncentraci cyklinu B. Existuje nad minimem požadovaným pro pokračování M fáze po vstupu, čímž chrání událost „všechno nebo nic“. Tato vstupní koncentrace se dále zvyšuje v případě neúplné replikace DNA, čímž se přidává další regulační mechanismus v bodě přechodu G2/M [20] . Přítomnost hystereze umožňuje silně řídit vstup do M fáze v závislosti na aktivitě cyklinu B-Cdk1.
Mechanismy, kterými je zabráněno mitotickému vstupu v reakci na poškození DNA, jsou podobné mechanismům v kontrolním bodě G1/S. Poškození DNA spouští aktivaci výše zmíněné dráhy ATM/ATR, ve které ATM/ATR fosforyluje a aktivuje kinázy kontrolního bodu Chk1/Chk2. Chk1/2 fosforyluje cdc25, který je nejen inhibován, ale také sekvestrován v cytoplazmě proteiny 14-3-3. 14-3-3 aktivuje p53, který, jak již bylo zmíněno dříve, je aktivován Chk1 a ATM/ATR. p53 také transaktivuje p21 a jak p21, tak 14-3-3 zase inhibují komplexy cyklinu B-cdc2 prostřednictvím fosforylace a cytoplazmatické sekvestrace cdc2. Kromě toho inaktivace cdc25 vede k jeho neschopnosti defosforylovat a aktivovat cdc2 [21] [22] . A konečně, dalším mechanismem reakce na poškození je down-regulace Plk1 pomocí ATM/ATR, což zase vede ke stabilizaci Wee1 a Myt1, které pak mohou fosforylovat a inhibovat cdc2, čímž udrží buňku v G2, dokud nebude poškození opraveno. opraveno [23] .
Na konci G2 buňka vstupuje do mitózy, ve které se dělí jádro. Přechod z G2 na M je dramatický; dojde k efektu vše nebo nic a přechod je nevratný. To je pro buňku výhodné, protože vstup do mitózy je kritickým krokem v životním cyklu buňky. Pokud není plně fixována, buňka bude mít mnoho problémů s částečným dělením, což nakonec pravděpodobně povede k buněčné smrti.
V žabích oocytech je indukována signální kaskáda, když se progesteron váže na membránově vázaný receptor. Mos je aktivován po proudu. Mos pak fosforyluje MEK1, který fosforyluje MAPK. MAPK má dvě role: aktivuje komplex cyklin B-Cdk1 k zahájení vstupu do mitózy a aktivuje Mos. Aktivace Mos má za následek pozitivní zpětnovazební smyčku, a proto funguje jako "přepínač", vytvářející vstup typu všechno nebo nic do mitózy.
Tato smyčka zpětné vazby byla poprvé objevena, když se ukázalo, že koncentrace MAPK-P (fosforylovaná MAPK) se zvyšují v reakci na zvýšené hladiny progesteronu [24] . Na úrovni jednotlivých buněk měla každá buňka buď plně fosforylovanou MAPK, nebo nefosforylovala MAPK, což naznačuje, že působí jako mechanismus podobný přepínači v každé buňce. Navíc se ukázalo, že blokování syntézy proteinů Mos způsobuje, že odpovědi MAPK-P jsou gradovanější, což naznačuje, že syntéza proteinu Mos je nezbytná pro vzorec aktivace MAPK typu „vše nebo nic“ [25] .
Tento proces lze pochopit pomocí bistability. Při použití grafu vpravo se rychlost syntézy Mos mění, jak se přidává více progesteronu. Každá křivka má stabilní pevné body a nestabilní pevné body. V nestabilních pevných bodech se systém bude pohybovat směrem k jakémukoli ze stabilních pevných bodů. Systém tedy může být buď ve stavu "zapnuto", nebo ve stavu "vypnuto", ale ne v přechodném stavu. Když jsou hladiny progesteronu dostatečně vysoké, křivka Mos se posune výše a nakonec překročí linii degradace pouze v jednom bodě, takže existuje pouze jeden stabilní stav „zapnuto“, což naznačuje vstup do mitózy.
Ireverzibilita, kterou pozorujeme v místě přechodu do mitózy, vyplývá z dostatečně vysoké hladiny progesteronu v buňce. Při dostatečně vysokých hladinách progesteronu je systém monostabilní v důsledku pozitivní zpětné vazby mezi Mapk a Mos. Bod, ve kterém se systém přepne z bistabilního na monostabilní, se nazývá bifurkace sedlového uzlu.
Ireverzibilní odezvu mitotického přechodu typu vše nebo nic tedy můžeme chápat pomocí matematického modelu molekulárních regulátorů jako bistabilního systému, který závisí na existenci pozitivní zpětné vazby. „Vypnutý stav“ je zničen dostatečně vysokými hladinami progesteronu, a jakmile buňka překročí stav vypnuto, uvízne v zapnutém stavu.
Na základě tohoto bistabilního modelu můžeme pochopit, že mitotický přechod závisí na hysterezi. Hystereze je definována jako závislost stavu systému na jeho historii. Nowak-Tysonův model je matematický model vývoje buněčného cyklu, který předpovídá, že nevratné přechody vstupující do mitózy a vycházející z ní jsou řízeny hysterezí. Model má tři hlavní předpovědi, které musí platit pro cyklické extrakty oocytů, jejichž progrese buněčného cyklu závisí na hysterezi [26] :
Sha et al provedli v roce 2003 experimenty s výtažky z vajec Xenopus laevis , aby prokázali tuto hysterickou povahu [27] . Pomocí cyklických extraktů zjistili, že práh aktivace Δ cyklinu B je 32 až 42 nM, zatímco práh inaktivace je 16 až 24 nM Δ cyklinu B. Tyto experimenty tedy potvrdily bistabilitu tohoto systému a důležitost hystereze v tomto buňka. smyčkový přechod. Při středních koncentracích cyklinu B je možný buď mezifázový nebo mitotický stav buňky.
Vzhledem k tomu, že vstup do mitózy je pro buňku velký a nákladný podnik, je logické, že by měly být zavedeny systémy, které zabrání předčasnému vstupu do této fáze. Ukázalo se, že chyby v předchozích krocích, jako je přítomnost nereplikovaných oblastí DNA, blokují progresi v buněčném cyklu [28] . Nowak-Tysonův model předpovídá, že je to způsobeno zvýšením hladiny cyklinu B potřebného pro vstup do mitózy [26] .
Sha et al zkoumali, zda to platí pro extrakty z vajec Xenopus . Použili afidicolin (APH) k inhibici DNA polymerázy a zabránění replikace DNA. Interfázová léčba cyklinem B zvýšila práh aktivace na 80–100 nM, jak předpovídá Nowak-Tysonův model [27] . Tyto experimenty tedy potvrzují, že stres nereplikované DNA v buňce ovlivňuje hysterezní smyčku a vede k mnohem vyššímu prahu pro vstup cyklinu B do mitózy.
Kontrolní bod mitotického vřeténka nastává v bodě metafáze , kdy všechny chromozomy musí/měly být zarovnány na mitotické ploténce a být pod bipolárním napětím. Napětí vytvořené touto bipolární připoutaností je to, co pociťujeme, což iniciuje vstup do anafáze. K tomu senzorický mechanismus zajišťuje, že anafázový stimulační komplex (APC/C) již není inhibován a může nyní volně degradovat cyklin B obsahující D-box (destrukční blok) a štěpit sekurin [29] . Posledně jmenovaný je protein, jehož funkcí je inhibovat separázu , která zase štěpí koheziny , proteinový kompozit zodpovědný za kohezi sesterských chromatid [30] . Jakmile je tento inhibiční protein degradován ubikvitinací a následnou proteolýzou, separáza indukuje separaci sesterských chromatid [31] . Poté, co se buňka rozdělí na dvě dceřiné buňky, vstoupí do G1.
Procesy opravy DNA a kontrolní body buněčného cyklu úzce souvisejí s rakovinou prostřednictvím svých funkcí regulujících stabilitu genomu a progresi buněk. Přesné molekulární mechanismy, které spojují dysfunkce těchto drah se specifickými rakovinami, nejsou ve většině případů dobře známy [32] . Ukázalo se, že ztráta ATM předchází rozvoji lymfomu, pravděpodobně v důsledku nadměrné homologní rekombinace vedoucí k vysoké genomové nestabilitě [33] . Narušení Chk1 u myší vedlo k významné dysregulaci kontrolních bodů buněčného cyklu, akumulaci poškození DNA a zvýšenému výskytu tumorigeneze [34] . Snad nejznámější dědičnost jediné BRCA1 nebo BRCA2 mutanty predisponuje ženy k rakovině prsu a vaječníků [35] . Je známo, že BRCA1 je nezbytný pro přechody S a G2/M a podílí se na buněčné odpovědi na poškození DNA. Předpokládá se, že BRCA2 se účastní homologní rekombinace a regulace kontrolního bodu S-fáze a deficitní mutace v BRCA2 jsou úzce spojeny s tumorigenezí [36] .
| buněčného cyklu | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Fáze |
| ||||||||||
| Regulátoři |
| ||||||||||