Vnořená polymerázová řetězová reakce

Nested polymerázová řetězová reakce ( anglicky  nested PCR  - „nested“ PCR) je dvoustupňová varianta PCR používaná ke snížení množství nespecifických reakčních produktů [1] . V první fázi se amplifikuje oblast , která zahrnuje cílový fragment DNA a jeho lemující sekvence (to znamená umístěné na okrajích fragmentu), ke které se nasedá první pár primerů . Ve druhém kroku se přidají primery, které jsou komplementární ke koncům cílového fragmentu. Protože produkt prvního stupně obsahuje cílový fragment (tj. konečný produkt uvnitř produktu prvního stupně), nazývá se tato variace PCR vnořená [1] .

Polymerázová řetězová reakce

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je proces amplifikace DNA pomocí enzymu DNA-dependentní DNA polymerázy . Taková reakce našla široké uplatnění v genetických laboratořích pro detekci přítomnosti určitého úseku DNA nebo RNA ve vzorcích (v druhém případě je nutné nejprve převést RNA na DNA reakcí reverzní transkripce ). PCR se také používá v genetickém inženýrství k získání potřebného fragmentu a jeho dalšímu použití při klonování , in vitro transkripci a dalším účelům. Důležitým krokem při přípravě reakce je výběr primerů, které mají být nasednuty na koncích cílového fragmentu. V tomto případě primery často nasedají také na jiné oblasti DNA, což vede ke směsi produktů. Pravděpodobnost, že k tomu dojde, se zvyšuje s počtem cyklů PCR [1] .

Primery

Nested PCR používá dva páry primerů přidaných ve dvou po sobě jdoucích reakčních krocích. První pár se nazývá externí a slouží k počáteční amplifikaci místa, které zahrnuje cílový fragment DNA, přičemž v této fázi se používá malý počet teplotních cyklů (od 15 do 30). Druhý pár, nazývaný interní, se žíhá na produkt prvního a používá se ve druhém stupni PCR s velkým počtem teplotních cyklů. Protože množství DNA obsahující cílový fragment po prvním kroku exponenciálně narůstá a primery použité v každém kroku jsou komplementární k různým sekvencím kolem cílové oblasti DNA, výsledná specifita reakce se zvyšuje. Tento přístup se často používá k získání vzácných fragmentů nebo oblastí s nízkou komplexitou (například sekvence bohaté na GC ) [2] .

Reakční kroky a protokol

Protokol nested PCR byl poprvé popsán v roce 1993 Kamolvarinem a kolegy pro diagnostiku vztekliny [3] . Od té doby se sled akcí prakticky nezměnil [4] . Původní protokol z článku je popsán níže.

První etapa

Po izolaci RNA byla provedena reverzní transkripce s použitím 50 pmol každého z páru externích primerů pro 1 μg materiálu. Směs obsahující fúzi RNA/ cDNA a primery byla poté doplněna na 50 ul pomocí PCR pufru obsahujícího 1,25 U. Taq-DNA polymeráza a 62,5 umol/l dDNP ( deoxyribonukleosidtrifosfát ). 50 ul minerálního oleje bylo navrstveno na vršek směsi a bylo provedeno 30 cyklů PCR (94 °C, 1 min (tání); 45 °C, 2 min (žíhání); 72 °C, 2,5 min (prodloužení)) [ 3] .

V prvním kroku se k amplifikaci tohoto fragmentu použije vnější pár primerů komplementárních k oblastem kolem cílového fragmentu DNA. Kromě cílového místa mohou primery také nasedat na jiná místa. Finální směs produktů prvního stupně obsahuje jak cílovou DNA, tak nečistoty [3] .

Druhá fáze

Pro druhou fázi nested PCR byl z první směsi odebrán alikvot 2 ul a přidán do 23 ul směsi obsahující 20 pmol vnitřních primerů komplementárních k oblastem samotného cílového fragmentu, 25 mmol/l dDNF a 1 jednotka Taq DNA polymerázy. Strávil 30 cyklů amplifikace se stejným programem jako v první fázi [3] .

V tomto případě je pravděpodobnost nasednutí primeru na jiné produkty prvního stupně extrémně nízká a ve většině případů je amplifikován pouze cílový fragment DNA [2] [3] .

Příklady použití

Nested PCR je široce používána v úlohách, které vyžadují vysokou specificitu, jako jsou: testovací systémy [5] , práce s malým množstvím materiálu [6] , purifikace vzorků DNA pro další analýzu a použití [7] .

Konkrétní případy použití pro vnořenou PCR:

Poznámky

  1. ↑ 1 2 3 Shen Chang-Hui. Amplification of Nucleic Acids  (anglicky)  // Diagnostic Molecular Biology. - 2019. - S. 215-247 . — ISBN 9780128028230 . - doi : 10.1016/B978-0-12-802823-0.00009-2 .
  2. ↑ 1 2 Haff L A. Vylepšená kvantitativní PCR s použitím vnořených primerů.  (anglicky)  // Genome Research. - 1994. - 1. června ( roč. 3 , č. 6 ). - str. 332-337 . — ISSN 1088-9051 . - doi : 10.1101/gr.3.6.332 .
  3. ↑ 1 2 3 4 5 Kamolvarin N. , Tirawatnpong T. , Rattanasiwamoke R. , Tirawatnpong S. , Panpanich T. , Hemachudha T. Diagnóza vztekliny polymerázovou řetězovou reakcí s vnořenými primery  //  Journal of Infectious Dis - 1993. - 1. ledna ( roč. 167 , č. 1 ). - S. 207-210 . — ISSN 0022-1899 . - doi : 10.1093/infdis/167.1.207 .
  4. ↑ Pelt-Verkuil, Elizabeth van, 1951-. Principy a technické aspekty PCR amplifikace . - [Dordrecht]: Springer, 2008. - 1 online zdroj (325 stran) str. - ISBN 978-1-4020-6241-4 , 1-4020-6241-9 , 978-1-4020-6240-7 281-24237-2.
  5. ↑ 1 2 Sun Yajuan , Chen Jiajun , Li Jia , Xu Yawei , Jin Hui , Xu Na , Yin Rui , Hu Guohua. Nový přístup založený na jedné zkumavce nested PCR a laterálním průtokovém proužku pro vysoce citlivou diagnostiku tuberkulózní meningitidy  //  PLOS ONE. - 2017. - 30. října ( roč. 12 , č. 10 ). — P.e0186985 . — ISSN 1932-6203 . - doi : 10.1371/journal.pone.0186985 .
  6. ↑ 1 2 Gallego Sandra , Mangano Andrea , Gastaldello René , Sen Luisa , Medeot Silvia. Užitečnost nested-polymerázové řetězové reakce pro molekulární diagnostiku lidského T-buněčného lymfotropního viru typu I/II  //  Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. - 2004. - Červen ( roč. 99 , č. 4 ). - str. 377-380 . — ISSN 0074-0276 . - doi : 10.1590/S0074-02762004000400006 .
  7. ↑ 1 2 Mamedov Ilgar Z. , Britanova Olga V. , Zvjagin Ivan V. , Turchaninova Maria A. , Bolotin Dmitriy A. , Putintseva Ekaterina V. , Lebedev Yuriy B. , Chudakov Dmitriy M. Preparing Unbiased T-cell Receptor and Antibody T-cell Receptor Knihovny cDNA pro hluboké profilování sekvenování nové generace  //  Hranice v imunologii. - 2013. - Sv. 4 . — ISSN 1664-3224 . - doi : 10.3389/fimmu.2013.00456 .
  8. ↑ Llop Pablo , Bonaterra Anna , Peñalver Javier , López María M. Vývoj vysoce citlivého postupu Nested-PCR s použitím jediné uzavřené zkumavky pro detekci asymptomatického rostlinného materiálu Erwinia amylovorain  //  Aplikovaná a environmentální mikrobiologie. - 2000. - 1. května ( roč. 66 , č. 5 ). - S. 2071-2078 . — ISSN 1098-5336 . - doi : 10.1128/AEM.66.5.2071-2078.2000 .
  9. ↑ Yang Xue , Hameed Uzma , Zhang Ai-Fang , Zang Hao-Yu , Gu Chun-Yan , Chen Yu , Xu Yi-Liu. Vývoj testu nested-PCR pro rychlou detekci Pilidiella granati v ovoci z granátového jablka  //  Vědecké zprávy. - 2017. - 20. ledna ( vol. 7 , č. 1 ). — ISSN 2045-2322 . - doi : 10.1038/srep40954 .
  10. ↑ Guo Ping , Yu Yongxin , Pan Yingjie , Yan Shuling , Wang Yongjie. Návrh a vyhodnocení nested PCR primerů pro specifickou detekci norovirů genoskupiny I v ústřicích  //  Molecular and Cellular Probes. - 2018. - Srpen ( sv. 40 ). - str. 40-43 . — ISSN 0890-8508 . - doi : 10.1016/j.mcp.2018.06.002 .
  11. ↑ Lin Chao , Ying Furong , Lai Yanan , Li Xiaolong , Xue Xiangyang , Zhou Tieli , Hu Dongwei. Použití nested PCR pro detekci trichomonád v tekutině z bronchoalveolární laváže  (anglicky)  // BMC Infectious Diseases. - 2019. - 10. června ( roč. 19 , č. 1 ). — ISSN 1471-2334 . - doi : 10.1186/s12879-019-4118-9 .
  Přejděte na položku Wikidata  Slovníky a encyklopedie