Konfokální mikroskopie (confokální laserová skenovací mikroskopie, CLSM ( anglicky confocal laser Scanning microscopy )) je druh světelné optické mikroskopie s výrazným kontrastem a prostorovým rozlišením oproti klasické světelné mikroskopii, které je dosaženo pomocí dírky (pinhole) umístěné v rovině obrazu a omezení toku pozadí rozptýleného světla vyzařovaného nikoli z ohniskové roviny čočky [1] . To umožňuje získat série snímků v různých hloubkách ohniskové roviny uvnitř vzorku (tzv. optické řezy vzorku do hloubky) a následně z těchto sérií rekonstruovat trojrozměrný obraz vzorku. Konfokální mikroskopie je široce používána v biologii, medicíně, vědě o materiálech a fyzice polovodičů.
V roce 1940 Hans Goldmann, oftalmolog v Bernu ve Švýcarsku, vyvinul systém štěrbinové lampy pro dokumentaci očních vyšetření [2] . Tento systém je některými pozdějšími autory považován za první konfokální optický systém. [3] [4]
V roce 1943 Zun Koana zveřejnil konfokální systém. [3] V roce 1951 popsal Hiroto Naora, kolega Koany, konfokální mikroskop v Science pro spektrofotometrii [5] .
V 50. letech potřebovali biologové zvýšit kontrast snímků objektů značených fluorochromem v řezech tlustých tkání [6] . K vyřešení tohoto problému navrhl Marvin Minsky , profesor na Massachusetts Institute of Technology v USA, použití konfokálního schématu pro fluorescenční mikroskopy. V roce 1957 získal Minsky patent na toto schéma [7] .
V 60. letech 20. století československý vědec Mojmír Petran z Lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Plzni vyvinul Tandemový skenovací mikroskop, první komerční konfokální mikroskop, který používal rotující disk – Nipkowův disk – k vytvoření a lokalizaci více bodových zdrojů buzení. a záření. [8] [9]
Československý patent podal v roce 1966 Petran a jeho kolega Milan Hadravský. První vědecká publikace s daty a snímky získanými pomocí tohoto mikroskopu od Davida Eggera z Yale University a samotného Mojmira Petrana byla publikována v časopise Science v roce 1967 [10] . Druhá publikace z roku 1968 popisuje teorii a technické detaily přístroje [11] . V roce 1970 byl vynález patentován ve Spojených státech. [12]
V letech 1969 a 1971 vědci David Egger a Paul Davidovich z Yale University publikovali průkopnické práce popisující první konfokální laserový skenovací mikroskop [13] [14] Byl to bodový skener, to znamená, že byl generován pouze jeden bod osvětlení. K pozorování nervové tkáně použili epiiluminaci v odraženém světle. Jako zdroj koherentního záření byl použit 5 mW helio-neonový laser s vlnovou délkou 633 nm . Laserový paprsek byl odražen poloprůhledným zrcadlem ve směru objektivu . Objektiv byl jednoduchý objektiv s ohniskovou vzdáleností 8,5 mm. Na rozdíl od všech předchozích (a následně pozdějších návrhů konfokálních systémů) byl vzorek snímán pohybem této čočky (objektivní snímání), což vedlo k pohybu ohniska. Odražené světlo bylo vráceno do průsvitného zrcadla, zaostřeno jinou čočkou na clonu ( pinhole ), za kterou byla umístěna trubice fotonásobiče . Signál byl vizualizován pomocí CRT osciloskopu , katodový paprsek se pohyboval současně s čočkou. Pomocí speciálního adaptéru bylo možné fotit na foťák Polaroid. Tři z takto získaných fotografií byly publikovány v roce 1971 [14] .
Rovněž byla vyvinuta schémata konfokálního rastrovacího mikroskopu Marvina Minského využívajícího laserové záření [15] . Hlavní pozornost výzkumníků byla v budoucnu směřována na analýzu využití fluorescenčních barviv pro in vivo studie a zlepšení kvality konfokálních obrazů zvýšením intenzity fluorescenčního záření.
V roce 1977 publikovali Colin J. R. Sheppard a Amargioti Chowdhury teoretickou analýzu konfokálních a laserových skenovacích mikroskopů. [16] Toto byla pravděpodobně první vědecká publikace, která používala termín „konfokální mikroskop“. [17] V roce 1978 publikovali Christoph Kremer a Thomas Kremer návrh konfokálního laserového rastrovacího mikroskopu využívajícího fluorescenční buzení s elektronickým autofokusem. [18] Tento model CLSM jako první spojil laserové skenování s volumetrickou detekcí biologických objektů označených fluorescenčními markery. V letech 1978 a 1980 popsala oxfordská skupina Colina Shepparda a Tonyho Wilsona konfokální systém s epi-laserovým osvětlením, skenovacím stupněm a fotonásobiči jako detektory. Stůl se mohl pohybovat podél optické osy, což umožnilo provádět trojrozměrné optické dělení po vrstvách [17] . V roce 1979 Fred Brackenhoff a kolegové prokázali, že teoretické výhody optického dělení a zlepšeného optického rozlišení jsou skutečně dosažitelné v praxi. [19] V roce 1983 publikovali I. Cox a S. Sheppard první práci, ve které byl konfokální mikroskop řízen osobním počítačem. [dvacet]
V polovině 80. let sestrojili William Bradshaw Amos a John Gralham White a kolegové z Laboratoře molekulární biologie v Cambridge první konfokální laserový skenovací mikroskop. [21] [22] V jeho optickém schématu bylo skenování prováděno postupným pohybem světelného paprsku nad vzorkem, nikoli pohybem tabulky vzorků. Toto schéma umožnilo výrazně zvýšit rychlost skenování díky odmítnutí inerciálních mechanických skenovacích systémů a dosáhnout rychlosti až čtyř snímků za sekundu (512 řádků v každém). [21]
Rada pro lékařský výzkum Spojeného království (MRC) paralelně sponzorovala vývoj prototypu moderního komerčního konfokálního mikroskopu, který později získala společnost Bio-Rad, počítačově řízený a komerčně dostupný jako „MRC 500“. Nástupce MRC 600 se později stal základem pro vývoj prvního dvoufotonového fluorescenčního mikroskopu, vyvinutého v roce 1990 na Cornell University. [19]
Výzkum provedený na Stockholmské univerzitě přibližně ve stejné době se také proměnil v komerční CLSM Sarastro. [23]
Podnik získal v roce 1990 Molecular Dynamics [24] , ale od dalšího vývoje systému bylo nakonec upuštěno.
V roce 1989 Fritz Karl a Eckhard Praikschat vynalezli skenovací laserový diodový mikroskop pro analýzu velikosti částic. [25] [26]
V Německu společnost Heidelberg Instruments, založená v roce 1984, vyvinula technologii CLSM, která byla původně určena pro průmyslové aplikace, nikoli pro biologii. Na počátku 90. let byla tato technologie aktivně vyvinuta společnostmi Leica Lasertechnik a Carl Zeiss , které již v té době úspěšně vyráběly světelné mikroskopy s implementovaným schématem skenování laserovým paprskem, které byly později upgradovány na konfokální systémy [27] .
Optické schéma běžného světelného mikroskopu tvoří obraz celé části vzorku nacházející se v hloubce ostrosti použitého mikroobjektivu a konfokální mikroskop tvoří obraz velmi tenkého řezu předmětu ve stejné hloubkové úrovni. Metody CLSM je v podstatě dosaženo řízením hloubky ostrosti optického systému.
Princip konfokálního zobrazování byl patentován v roce 1957 Marvinem Minskym [28] [29] a jeho cílem je překonat některá omezení tradičních fluorescenčních mikroskopů. V běžném (širokoúhlém) fluorescenčním mikroskopu je celý vzorek rovnoměrně osvětlen zdrojem záření mikroskopu. V tomto případě je celý vzorek ozařován a excitován současně a výsledná fluorescence je detekována pomocí fotodetektoru nebo mikroskopické kamery včetně velké části pozadí objektu. Naproti tomu konfokální mikroskop používá bodové světlo (viz Funkce Point Spread Function ) a dírku v optické konjugované rovině před detektorem k eliminaci signálu rozostřeného. Fluorescenční záření je tedy detekováno pouze z ohniskové roviny, takže optické rozlišení obrazu, zejména podél osy Z (podél hloubky vzorku), je mnohem vyšší než u běžných světelných mikroskopů. Protože je však většina fluorescence ze vzorku blokována, je zvýšení rozlišení doprovázeno snížením intenzity užitečného signálu. Pro kompenzaci tohoto vedlejšího efektu se používá delší expozice detektoru a vysoce citlivé fotodetektory, obvykle PMT nebo lavinová fotodioda , které převádějí optický signál na elektrický s následnou registrací na osobním počítači [30] .
Protože je na vzorku zaznamenán pouze jeden fluorescenční bod, je k vytvoření 2D nebo 3D obrazu vyžadován rastrový sken vzorku. Laserový paprsek se pohybuje podél vzorku v horizontální rovině pomocí jednoho nebo více zrcadel s řízeným úhlem sklonu. Tato metoda skenování má obvykle nízkou rychlost skenování, která se však může lišit. Například pomalejší skenování poskytuje lepší poměr signálu k šumu, což má za následek lepší kontrast a vyšší rozlišení.
Jak je známo, hloubka ostrosti CLSM je přímo úměrná vlnové délce použitého záření a nepřímo úměrná numerické apertuře mikroobjektivu a závisí také na optických vlastnostech vzorku. Díky tomu probíhá v CLSM softwarová rekonstrukce bodu 3D objektů pomocí různých algoritmů. Nejběžnější je algoritmus pro hledání maxima intenzity. [31]
Konfokální mikroskop má stejné rozlišení jako běžný mikroskop a je omezen difrakčním limitem .
kde je vlnová délka záření, je numerická apertura objektivu, je index lomu média mezi vzorkem a objektivem, je polovina úhlu, který objektiv „zachytí“. Ve viditelné oblasti je rozlišení ~ 250 nm (NA=1,45, n=1,51).V posledních letech však byly úspěšně vyvinuty konstrukce mikroskopů, které využívají nelineární vlastnosti fluorescence vzorků. V tomto případě je dosaženo rozlišení, které je mnohem menší než difrakční limit a činí ~ 3–10 nm [32] [33] [34] [35] .
Podívejme se nyní na otázku zvýšení kontrastu při použití konfokálního optického schématu. Za prvé, protože světlo prochází čočkou dvakrát v konfokálním mikroskopu, má funkce rozostření bodu (dále jen PSF ) následující podobu:
,
kde Pconf je funkce rozostření konfokálního bodu a p je funkce běžného rozostření bodu.
Dosažitelná tloušťka ohniskové roviny je tedy určena především vlnovou délkou použitého záření dělenou numerickou aperturou objektivu a závisí také na optických vlastnostech vzorku. Vzhledem ke svému tenkému optickému průřezu jsou tyto typy mikroskopů zvláště vhodné pro 3D zobrazování a povrchové profilování vzorků.
Sekvenční řezy tvoří "z-stack", který může být zpracován určitým softwarem za účelem vytvoření 3D vykresleného obrazu nebo prezentován ve 2D stohu pro publikaci, díky společnému algoritmu vyhledávání maximální intenzity. [31]
Konfokální mikroskopie poskytuje přímé, neinvazivní sekvenční optické řezání neporušených tlustých živých preparátů s minimálními nároky na přípravu a také s vyšším laterálním rozlišením ve srovnání s konvenční světelnou mikroskopií [36] [37] . Biologické vzorky se typicky kontrastně barví fluorescenčními barvivy, aby se zviditelnily jejich specifické oblasti nebo organely. Skutečná koncentrace barviva však může být udržována velmi nízká, aby se minimalizoval dopad na biologické systémy. Některé konfokální systémy tedy mohou sledovat jednotlivé fluorescenční molekuly [38] . Kromě toho mohou transgenní technologie vytvářet organismy, které produkují své vlastní fluorescenční chimérické molekuly (značené GFP, zelený fluorescenční protein) [39] .
Konfokální laserový rastrovací mikroskop s vysokým kontrastem poskytuje dvě neocenitelné příležitosti: umožňuje zkoumat tkáně na buněčné úrovni ve stavu fyziologické vitality a také vyhodnocovat výsledky (dynamiku) buněčné aktivity ve čtyřech dimenzích - výška, šířka, hloubka a čas. [40]
Při použití Rayleighova kritéria pro rozlišení (pokles 26 % distribučního maxima) zjistíme, že rozlišení v konfokálním mikroskopu se zvyšuje, ale ne významně. Pro konfokální mikroskop je rozlišení (rc ) definováno následovně [8] [41] [1] :
,
kde n je relativní index lomu, D je průměr vstupní pupily optického systému, λ je vlnová délka, F je ohnisková vzdálenost mikroobjektivu, θ je úhel apertury mikroobjektivu, λ'=λ/n . Pro konvenční světelný mikroskop rozlišení (r r ):
Hlavní výhodou konfokálního mikroskopu však není zvýšení rozlišení ve smyslu Rayleighova kritéria, ale výrazné zvýšení kontrastu. Konkrétně pro konvenční PSF v ohniskové rovině je poměr amplitudy v prvním laterálním maximu k amplitudě hlavního maxima 2 %, v případě konfokálního mikroskopu bude tento poměr 0,04 %.
Konfokální mikroskopie poskytuje zvýšení kontrastu obrazu pomocí fokusovaného osvětlení (excitace) v oblasti analýzy a fluorescenční clony v rovině obrazu. Toto zvýšení kontrastu má za následek možnost rozlišení objektů s rozdílem intenzity až 200:1 a také poskytuje zvýšení rozlišení, a to jak v rovině objektu, tak podél optické osy. Spolu se zvýšením kontrastu umožňuje fluorescenční konfokální mikroskopie poskytnout krok za krokem trojrozměrnou rekonstrukci studovaného objektu pomocí vícebodového osvětlení. Z nejmodernějších metod rastrovací konfokální mikroskopie je třeba vyzdvihnout použití skenovacího disku s mikrodiafragmami a použití matricových fotodetektorů [2] .
Dnes existují metody, které dokážou výrazně zvýšit rozlišovací schopnost konfokálního mikroskopu. V běžném konfokálním mikroskopu je excitační světlo zaostřeno na jeden bod na vzorku, po kterém následuje detekce emisního fluorescenčního signálu. Emise mimo ohnisko je odříznuta dírkou (pinhole), jejíž velikost určuje, kolik maxim Airyho disku dosáhne detektoru. Zvýšení rozlišení lze dosáhnout zmenšením průměru membrány (pinhole), ale poměr signálu k šumu se výrazně sníží v důsledku snížení intenzity emisního záření procházejícího membránou. Alternativou k takovému skenování je použití detektorů pole [42] [43] , které současně registrují rozložení intenzity podél laterální roviny vzorku současně z celé plochy Airyho disku, kde každý fotocitlivý prvek funguje jako dírkový otvor. S použitím detekčního algoritmu s 32kanálovým maticovým detektorem (Airyscan [44] [45] ) se tedy ukázalo, že je možné překročit klasický limit rozlišení (difrakční limit) více než 1,7krát ve všech třech rozměrech: do 140 nm laterálně a 400 nm axiálně při vlnové délce 488 nm [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] .
CLSM je široce používán téměř ve všech odvětvích biologie, od buněčné biologie a genetiky po mikrobiologii a vývojovou biologii. Používá se také v kvantové optice a nanokrystalickém zobrazování a spektroskopii.
Biologie a medicínaKlinicky se CLSM používá ke zkoumání různých očních onemocnění, zejména k zobrazování, kvalitativní analýze a kvantifikaci endoteliálních buněk rohovky [53] . Používá se k lokalizaci a identifikaci přítomnosti filamentózních plísňových filament ve stromatu rohovky v případech keratomykózy, což umožňuje rychlou diagnostiku a včasné podání správné terapie. Jako slibné se jeví i provádění endoskopických výkonů ( endomikroskopie ) metodou CLSM [54] . Ve farmaceutickém průmyslu bylo doporučeno používat tento přístup ke sledování výrobního procesu tenkovrstvých lékových forem, ke kontrole kvality a rovnoměrnosti distribuce léčivých látek.
Optika a krystalografieCLSM se používá jako mechanismus obnovy dat v některých 3D optických systémech ukládání dat nebo mapování chemických sloučenin, stejně jako ve fyzice polovodičů a spintronice (zejména při studiu vlastností NV center ). [55] [56] .
Série konfokálních snímků (z-stack) demonstrující distribuci aktinových filament v buněčné linii osteosarkomu U2OS
3D rekonstrukce série konfokálních snímků jádra fixovaných HeLa buněk, transgenní chimérický protein histon H2B-GFP
Řez listu Pteridium aquilinum
Konfokální obraz příčného řezu stonku Lycopodium annotinum
Průřez listem Dryopleris filix-mas
Konfokální obraz fragmentu mince "1 euro"
Dvoukanálový konfokální obraz mitotických mikrotubulů
Slovníky a encyklopedie | |
---|---|
V bibliografických katalozích |